Validación del método analítico para la determinación de glimepirida en plasma humano por HPLC/UV con adición de estándar empleando glibenclamida como estándar interno (Validation of analytical method for the determination of glimepiride in human plasma by HPLC/UV with addition standard using glibenclamide as an internal standard)

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g/mL. The method was sufficiently sensitive for pharmacokinetic studies of Glimepiride in human plasma.

Publicado el : sábado, 01 de enero de 2005
Lectura(s) : 61
Fuente : Ars Pharmaceutica 0004-2927 2005 Volumen 46 Número 4
Número de páginas: 17
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VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE GLIMEPIRIDA EN PLASMA HUMANO POR HPLC/UV... 411
VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF GLIMEPIRIDE IN HUMAN PLASMA BY HPLC/UV...
Validación del método analítico para
la determinación de glimepirida en plasma
humano por HPLC/UV con adición de estándar
empleando glibenclamida como estándar interno
Validation of analytical method for the determination of glimepiride
in human plasma by HPLC/UV with addition standard using
glibenclamide as an internal standard
1 2 3 4 5MILENA G , RAMÍREZ G , VELÁSQUEZ O , PÉREZ M , RESTREPO P
11111Q.F. Director del Laboratorio Biofarmacéutico. CIDEIM.
2Q.F. Asistente de Investigación. CIDEIM.
3Ph.D. Químico. Asesor validación de la metodología analítica. ECOQUÍMICA.
4Estadístico. Unidad de Biometría. CIDEIM.
5 MSc. Farmacología. Coordinador Unidad de Estudios Biofarmacéuticos. CIDEIM.
RESUMEN
Se desarrolló un método para la detección y cuantificación de Glimepirida en plasma humano, con
elución isocrática por cromatografía líquida de fase reversa, con detección ultravioleta a 231 nm,
empleando el método de adición de estándar. Se utilizó Glibenclamida como estándar interno. Este
método involucra una extracción líquida de los principios activos (Glimepirida y Glibenclamida) usando
una mezcla de diclorometano:dietiléter (30:70 v/v). La separación se realizó en una columna C en fase en fase en fase
1818181818
reversa y la fase móvil consistió de una mezcla de acetonitrilo:agua (45:55 v/v) ajustado a pH 3.3±0.1
con ácido acético glacial. El método se validó en el rango de concentraciones de 0.001 a 1.0 µg/mL con
adición de estándar de Glimepirida de 0.25 µg/mL. La curva de calibración fue lineal en el rango de
concentraciones establecido. Se evaluó la reproducibilidad, estabilidad y porcentaje de recuperación del
método. El método para la determinación de Glimepirida en plasma humano por HPLC/UV fue preciso
y exacto, con un límite de cuantificación de 0.2025 µg/mL. Este método fue suficientemente sensible
para su aplicación en estudios farmacocinéticos de glimepirida.
PALABRAS CLAVE: Glimepirida. Glibenclamida. Extracción Líquido-Líquido. Método de adición de estándar. HPLC/UV.
ABSTRACT
A method for detection and quantification of Glimepiride in human plasma has been developed using an
isocratic elution on reversed phase liquid chromatography with ultraviolet detection at a single wavelength
(231 nm) and the addition standard method. Glibenclamide was used as an internal standard. This method
involves a liquid-liquid drug extraction (Glimepiride and Glibenclamide) from plasma using dichloromethane-
diethyl ether (30:70%v/v). Separation was achieved on a C reversed phase column and the mobile phase
1818181818
consisted of 45% acetonitrile and 55% water (adjusted to pH 3.3±0.1 with acetic acid glacial). The assay
has been validated over a concentration range of 0.001 to 1.0 µg/mL with addition of Glimepiride 0.25
µg/mL. Calibration curve was linear in the described concentration range. The reproducibility, stability
and recovery of the method were evaluated. Determination of Glimepiride in human plasma by HPLC/
UV method was accurate and precise with a quantitation limit of 0.2025 µg/mL. The method was
sufficiently sensitive for pharmacokinetic studies of Glimepiride in human plasma.
KEYWORDS: Glimepiride. Glibenclamide. Liquid-liquid extraction. addition standard method. HPLC/UV.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 411-427.MILENA PÉREZ G, GLORIA RAMÍREZ C, OMAR VELÁSQUEZ, MAURICIO PÉREZ F, PIEDAD RESTREPO V.412
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
El principio activo glimepirida, hipoglice- The active principle glimepiride is an oral
miante oral del grupo de las sulfonilúreas, es blood-glucose-lowering drug of the sulfonylurea
un polvo cristalino, blanco, ligeramente ama- class. Glimepiride is a white to yellowish-white,
rillo y prácticamente inodoro. Químicamente, crystalline, odorless to practically odorless
es 1-[[p-[2-(3-ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline- powder. Chemically, glimepiride is identified
1-carboxamido) ethyl] phenyl]sulfonyl]-3-(trans- as 1-[[p-[2-(3-ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-
4-methylcyclohexyl) urea. Es prácticamente 1-carboxamido) ethyl] phenyl]sulfonyl]-3-(trans-
insoluble en agua, tiene un peso molecular de 4-methylcyclohexyl) urea. Is practically inso-
490.62. Su fórmula molecular es C H N O S luble in water, has a molecular weight of
24 34 4 5
1y su fórmula estructural, la siguiente : 490.62. Its molecular formula is C H N O S.
24 34 4 5
1The structural formula is :
La glimepirida pertenece al grupo de las The primary mechanism of action of gli-
sulfonilúreas, identificado como de segunda mepiride in lowering blood glucose appears
generación, con potencia considerablemente to be dependent on stimulating the release of
mayor que las de primera generación. La gli- insulin from functioning pancreatic beta cells.
mepirida actúa sobre los receptores de mem- In addition, extrapancreatic effects may also
brana de las células β pancreáticas, estimu- play a role in the activity of sulfonylureas
lando la liberación de insulina y disminuyendo, such as glimepiride. This is supported by both
en consecuencia, los niveles de glucosa san- preclinical and clinical studies demonstrating
guínea. that glimepiride administration can lead to
Los efectos extrapancreáticos también pue- increased sensitivity of peripheral tissues to
22den desempeñar un papel importante en la insulin
actividad hipoglicemiante de las sulfonilúreas In addition, the mechanism of action of the
como la glimepirida, puesto que los estudios sulfonylurea class has been associated with
preclínicos y clínicos demostraron que la ad- the reduction of the hepatic depuration of the
ministración de glimepirida puede conducir a insulin, the changes in the chronic response
la disminución de la sensitividad incrementa- of the insulin at the oral glucose levels, the
2da de los tejidos periféricos a la insulina . regulation to the loss of the receptors of ce-
Sumado a lo anterior, el mecanismo de llular surface, the stimulation of somastatin
acción de las sulfonilúreas se ha asociado con by the sulfonylurea class and the suppression
la disminución de la depuración hepática de of the liberation of glucagon, among others.
la insulina, los cambios en la respuesta cróni- These elements of analysis show complex ways
ca de la insulina a los niveles de glucosa oral, that explain the effective interaction for the
la regulación a la baja de los receptores de regulation of glycemic in diabetic patients type
superficie celular, la estimulación de somasta- II, whose hyperglycemia could not solely be
tina por las sulfonilúreas y la supresión de la controlled with the diet and the exercise. The
liberación de glucagón, entre otros. Estos ele- effects of the glimepiride are initiated when it
Ars Pharm 2005; 46 (4): 411-427.VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE GLIMEPIRIDA EN PLASMA HUMANO POR HPLC/UV... 413
VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF GLIMEPIRIDE IN HUMAN PLASMA BY HPLC/UV...
mentos de análisis muestran vías complejas is united and blocked to the receptors of the
que explican la interacción efectiva para la sensible potassium channels to ATP, reducing
regulación de la glicemia en pacientes diabé- the conductance to potassium of such, cau-
ticos tipo II, cuya hiperglicemia no pudo ser sing the depolarization of the membrane, what
controlada con la dieta y el ejercicio única- facilitates the entrance of calcium ions through
mente. Los efectos de la glimepirida son ini- the sensible channels to the voltage, neces-
3ciados cuando ésta se une y bloquea los re- sary effect for the insulin secretion. .
ceptores de los canales de potasio sensibles a Glibenclamide used in this method as an
ATP, reduciendo la conductancia al potasio internal standard, is a potent second genera-
de los mismos, causando la despolarización tion oral sulfonylurea antidiabetic agent wide-
de la membrana, lo que facilita el ingreso de ly used for the treatment of type II diabetes
4iones de calcio a través de los canales sensi- mellitus . The structural formula is:
bles al voltaje, efecto necesario para la secre-
3ción de insulina .
La glibenclamida, usado en este método
como estándar interno, es un potente agente
antidiabético del grupo de las sulfonilúreas de
segunda generación, usado para el tratamien-
4to de la diabetes mellitus tipo II . Su fórmula
estructural es:
Actualmente, la mayoría de los métodos At the moment, most of the referenced
methods for the determination of glimepiridereferenciados para la determinación de glime-
pirida en plasma humano, usan cromatografía in human plasma use Liquid Chomatography-
5,6,7.líquida acoplada a masas Estos métodos Electrospray Ionization Tandem Mass Spec-
5,6,7.requieren de instrumentación sofisticada y no trometry These methods mostly need ins-
disponible en nuestros laboratorios. truments that are sophisticated and therefore
they are not available in ours laboratories.Este artículo describe un método adecuado
para la determinación de glimepirida en plas- This paper describes a suitable method for
ma humano por HPLC/UV para aplicación en the determination of glimepiride in human
estudios farmacocinéticos. plasma by HPLC/UV for its application in
pharmacokinetic studies.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Glimepirida estándar fue obtenido de Syn-
fine Research. Glibenclamida usado como
Ars Pharm 2005; 46 (4): 411-427.MILENA PÉREZ G, GLORIA RAMÍREZ C, OMAR VELÁSQUEZ, MAURICIO PÉREZ F, PIEDAD RESTREPO V.414
estándar interno fue obtenido de Chemo. MATERIALS AND METHODS
Acetonitrilo (Fisher Scientific) y agua fueron
grado HPLC. Ácido acético glacial (Panreac), Chemicals
metanol (Panreac), etanol (Licorera del Va-
lle), diclorometano (EM Science) y dietiléter Glimepiride was obtained from Synfine
(Merck), fueron grado analítico. Research. Glibenclamide used as an internal
standard was obtained from Chemo. Acetoni-
trile (Fisher Scientific) and water was HPLC
Instrumentación y Cromatografía grade. Acetic acid glacial (Panreac), methanol
(Panreac), ethanol (Licorera del Valle), dichlo-
El estudio fue realizado con un equipo de romethane (EM Science) and diethyl ether
cromatografía líquida LaChrom Elite (Merck- (Merck), were analytical grade.
Hitachi) y un detector ultravioleta con arreglo
®de diodos, Columna Chromolith Performan-
ce RP-18e 100-4.6 mm, 2µm (Merck), soft- Instrumentation and Chromatography
ware EZChrom Elite 3.1.3 (Merck), balanza
analítica (Ohaus Adventurer), agitador vortex Chromatography was performed with a high-
(Fisher Scientific), agitador magnético (Mul- performance liquid chromatograph LaChrom
tistation IKA), baño ultrasónico (Fisher Scien- Elite (Merck-Hitachi) and an UV detector with
®tific), baño maría (DIES), sistema de vacío diodes array, Chromolith Performance RP-
(Labconco), bomba de vacío (Precision), pu- 18e 100-4.6 mm, 2µm. (Merck), Data station
rificador de agua (Simplicity Millipore), cen- with EZChrom Elite 3.1.3 software (Merck),
trifuga (IEC Centra-7R), congelador -70 ºC (Ohaus Adventurer) analytic balance, Vortex
(Revco), pH metro (WTW Inolab pH 740). shaker (Fisher Scientific), Magnetic shaker
(Multistation IKA), Ultrasonic bath (Fisher
Scientific), Water bath (DIES), Vaccum sys-
SECCIÓN EXPERIMENTAL tem (Labconco), Vaccum pump (Precision),
Ultra Pure Water Production (Simplicity Milli-
Preparación de la Solución de Estándar Inter- pore), Centrifuge (IEC Centra-7R), Freezer -
no 70 ºC (Revco), pH meter (WTW Inolab pH
740).
Transferir 10.0 mg de glibenclamida exac-
tamente pesados, a un balón volumétrico de
100 mL, disolver y diluir a volumen con EXPERIMENTAL SECTION
metanol:agua (70:30 v/v) y mezclar. Tomar
1.0 mL de esta solución y llevar a un balón Internal Standard solution preparation
volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con
metanol:agua (70:30 v/v) y mezclar. Esta so- Transfer about 10.0 mg of glibenclamide
lución tiene una concentración de 1.0 µg/mL. accurately weighed, to a 100 mL volumetric
flash, dissolve and dilute with methanol:water
(70:30 v/v) to volume, and mix. Pipet 1.0
Preparación de la Solución stock de Glimepirida mL of this solution to a 100 mL volumetric
flash, dilute with methanol:water (70:30 v/v)
Transferir 20.0 mg de glimepirida exacta- to volume, and mix. This solution has a con-
mente pesados, a un balón volumétrico de 100 centration of about 1.0 µg/mL.
mL, disolver y diluir a volumen con etanol
95% (200 µg/mL). Tomar 1.0 mL de esta
solución y llevar a un balón volumétrico de Glimepiride Stock solution preparation
100 mL, diluir a volumen con metanol:agua
(70:30 v/v) y mezclar. Esta solución tiene una Transfer about 20.0 mg of glimepiride ac-
concentración de 2.0 µg/mL. curately weighed, to a 100 mL volumetric flash,
dissolve in and dilute with ethanol 95% to
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Preparación de las Soluciones de Trabajo de volume, and mix (200 µg/mL). Pipet 1.0 mL
Glimepirida of this solution to a 100 mL volumetric flash,
dilute with methanol:water (70:30 v/v) to
volume, and mix. This solution has a concen-Tomar los volúmenes descritos en la Tabla
1, de la solución de glimepirida de 2.0 µg/ tration of about 2.0 µg/mL.
mL, llevar a balones volumétricos de 10 mL
y diluir con metanol:agua (70:30 v/v).
Glimepiride working solutions preparation
Pipet the volumes described in the table 1
of glimepiride solution of 2.0 µg/mL into 10
mL volumetric flash and mix with
methanol:water (70:30 v/v).
TABLA 1. Soluciones de trabajo de glimepirida para la preparación de los estándares.
TABLE 1.TABLE 1. Glimepiride working solutions for the standards preparation.
Volumen (uL) adicionado de
Concentración Final Volumen Final
solución de Glimepirida de 2,0 Solución
(ng/mL) (mL)
ug/mL
Final Concentration Added volume (uL) of the Final Volume
Solution
(ng/mL) Glimepiride solution 2,0 ug/mL (mL)
1 2,0 10,0 10,0
2 12,562,5 10,0
3 25,0125,10,0
4 50,0 250,0 10,0
5 70,0350,10,0
6 90,0450,10,0
7 110,0 550,0 10,0
8 130,650,10,0
9 150,750,10,0
10 170,0 850,0 10,0
11 200,1000,0 10,0
12 400,2000,010,0
13 600,0 3000,010,0
14 800,0 4000,0 10,0
15 1000,0 5000,010,0
16200,06000,010,0
17400,07000,0 10,0
18 1600,0 8000,010,0
19800,09000,010,0
20 2000,0 0,0 0,0
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Preparación de la Solución de Adición de Glimepiride addition solution preparation
Glimepirida
Transfer 0.5 mL of the glimepiride solu-
Transferir 0.5 mL de la solución de glime- tion of 200 µg/mL, to a 100 mL volumetric
pirida de 200 µg/mL a un balón volumétrico flash, dilute with methanol:water (70:30 v/v)
de 100 mL, disolver y diluir a volumen con to volume, and mix. This solution has a con-
metanol:agua (70:30 v/v) y mezclar. Esta so- centration of about 1.0 µg/mL. Pipet the vo-
lución tiene una concentración de 1.0 µg/mL. lumes described in the table 2 of glimepiride
Tomar los volúmenes descritos en la Tabla 2, solution of 1.0 µg/m and mix with the solu-
de la solución de glimepirida de 1.0 µg/mL y tions described.
mezclar con las soluciones descritas.
Calibration Standard solutions preparation
Preparación de las Soluciones Estándar de
Calibración Pipet the volumes describes in the table 2
of each glimepiride working solution and mix
Tomar los volúmenes descritos en la Tabla with the solutions described.
2, de cada solución de trabajo de glimepirida
y mezclar con las soluciones descritas.
TABLA 2. Preparación de los estándares de calibración. Aplicación del método de adición de estándar.
TABLE 2.TABLE 2. Calibration standards preparation with standard addition method.
Glimepirida. Solución de trabajo
Volumen adicionado
Volumen adicionado (uL)
Concentración Volumen plasma (uL) de solución de Volumen Volumen Solución de solución de Glimepirida Concentración Solución de Final (ng/mL) adicionado (uL) Glibenclamida de 1,0 Final (mL) adicionado de 1,0 ug/mL trabajo (ng/mL) ug/mL (uL)
Glimepiride. Working solution
Final Add volume (uL) Add volume (uL) Final
Add plasma
Solution Concentration Glibenclamide Glimepiride solution of 1,0 Volume volume (uL) Add Volume Working solution (ng/mL) solution of 1,0 ug/mL ug/mL (mL)
(uL) Concentration (ng/mL)
1 1,00 500,0 2,0 500,0 400,0 200,0 1,6
2 6,25500,012,5 500,400,0200,1,
3 12,50 500,025,0500,400,0200,1,
4 25,0500,0 50,0500,0 400,0 200,0 1,6
5 35,0500,070,0 500,400,0200,1,
6 45,00 500,090,0500,400,0200,1,
7 55,0500,0 110,0500,0 400,0 200,0 1,6
8 65,0500,0130,0 500,400,0200,1,
9 75,00 500,0150,0500,400,0200,1,
10 85,0500,0 170,0500,0 400,0 200,0 1,6
11 100,00 500,0200,0 500,400,0200,1,
12 200,00500,0 400,0500,400,0 200,1,
13 300,00 500,0600,0 500,0 400,0 200,0 1,6
14 400,00500,0 800,0500,400,0200,1,
15 500,00 500,01000,0 500,0 400,0 200,0 1,6
16 600,00500,0 1200,500,0400,200,01,6
17 700,00 500,01400,500,0 400,200,0 1,6
18 800,00500,0 1600,0 500,0400,0 200,01,6
19 900,00 500,01800,500,0 400,200,0 1,6
20 1000,00500,0 2000,500,0400,200,01,6

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VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF GLIMEPIRIDE IN HUMAN PLASMA BY HPLC/UV...
Preparación de la Solución de Extracción Extraction solution preparation
Preparar una mezcla de diclorometano: Prepare a mixture of dichloromethane:dietyl
dietiléter (30:70 v/v). Esta preparación debe ether (30:70 v/v). This preparation should be
realizarse en cabina extractora de gases y performed in a fume cupboard.
humos.
Mobile Phase preparation
Preparación de la Fase Móvil
Prepare a mixture of acetonitrile:water (45:55
Preparar una mezcla de acetonitrilo:agua v/v) and adjust the pH to 3.3±0.1 with acetic
(45:55 v/v) y ajustar el pH a 3.3±0.1 con ácido acid glacial.
acético glacial.
Glimepiride calibration standards extraction
Extracción de los Estándares de Calibración
de Glimepirida 6 mL of dichloromethane:dietyl ether (30:70
v/v) was added to each tube which containing
A cada tubo que contiene una concentra- a glimepiride concentration. The mixture was
ción de estándar de glimepirida, adicionar 6 agitated and centrifuged for 25 minutes at 2800
mL de la mezcla diclorometano:dietiléter (30:70 rpm and 25°C. After, the samples were frozen
ov/v), agitar en vortex durante un minuto para at -70 C for 10 min. The clear supernatant
was transferred into a glass tube. The liquidque se realice la extracción y posteriormente
centrifugar durante 25 minutos, a 2800 rpm y phase was evaporated to dryness under va-
25°C. Congelar a -70 °C durante 10 minutos, cuum in a bath at 40ºC. The residue was then
transferir el sobrenadante a otro tubo de ensa- reconstituted in 500 µL of mobile phase and
yo y evaporar el solvente en baño maría a injected 50 µL into the Chromatograph.
40°C durante 30 minutos, luego secar el resi-
duo en baño maría a 40°C con ayuda de un
sistema de vacío a 26 pulgadas de mercurio, Chromatographic Conditions
durante 20 minutos. Finalmente, disolver el
residuo seco con 500 µL de una mezcla de The Fig. 1 shows a typical chromatogram
acetonitrilo:agua (45:55 v/v), agitar en vortex from glimepiride and glibenclamide obtained
durante un minuto, filtrar a través de mem- with the conditions showed in the table 3.
brana de 0.45 µ e inyectar en el cromatógra-
fo.
Condiciones Cromatográficas
La Figura 1 muestra un cromatograma típi-
co de glimepirida y glibenclamida obtenido
con las condiciones presentadas en la Tabla 3.
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TABLA 3.TABLA 3.TABLA 3.TABLA 3.TABLA 3. Condiciones cromatográficas.
TABLE 3.TABLE 3.TABLE 3. TABLE 3.TABLE 3. Chromatographic conditions.
Condiciones
Parámetros Instrumentales
Conditions
Instrumental Parameters
Modo de elución Isocrático
Elution mode Isocratic
Flujo
1.5 mL/min
Flow Rate
Volumen de Inyección
50 µL
Injection volume
Longitud de onda
231 nm
Wavelength
Columna
Chromolith Performance RP-18e 100-4.6 mm, 2µm.
Column
Temperatura de la columna
30 °C
Column Temperature
Temperatura del automuestreador
25 °C
Autosampler Temperature
Presión
420 psi
Pressure
Modo de cuantificación Estándar Interno
Quantification mode Internal standard
Modo de cualificación Tiempo de retención
Qualification mode Retention time
Modo de calibración Curva de calibración
Calibration mode Calibration curve
Unidades de concentración
ng/mL
Concentration units
Tiempos de Retención Glibenclamida: 4.5 min.
Retention times Glimepirida: 5.4 min.
Tiempo de corrida 7 minutos
Run time 7 minutes

Validación del Método de Valoración Validation of the assay method
Linealidad Linearity
La linealidad del método es la relación entre The method linearity is the relationship
la respuesta del instrumento y concentracio- between the instrument response and know
8 8nes conocidas de analito . Para su evaluación concentrations of the analyte . Plasma sam-
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se prepararon 20 concentraciones de glimepi- ples were spiked in three replicates at 20
rida, por triplicado en el rango de 0.001 a 1.0 concentrations ranged 0.001 to 1.0 µg/mL with
µg/mL más la adición de 0.25 µg/mL de gli- addition glimepiride standard 0.25 µg/mL. The
mepirida, y se determinaron cada una por tri- samples were assayed using the method des-
plicado. Las muestras fueron analizadas em- cribed above. The standard calibration curves
pleando la metodología descrita. La curva de for glimepiride were constructed using the
calibración para glimepirida fue construida analyte/internal standard peak-area-ratios ver-
usando la relación de áreas de analito a están- sus the concentrations of the analytes. Linear
dar interno versus las concentraciones de least-squares regression analysis was perfor-
analito. Se realizó el análisis de regresión li- med to asses the linearity as well as to gene-
neal para determinar la linealidad del método rate the standard calibration equation: y= mx
así como para generar la ecuación de la curva + b, where y is the peak-area-ratio, x the
de calibración: y= mx + b, donde y es la re- concentration, m the slope and b the intercept
lación de área, x la concentración, m la pen- of the regression line.
diente y b el intercepto.
Precision and accuracy
Precisión y Exactitud
The precision of an analytic method des-
La precisión del método analítico describe cribes the closeness of agreement (degree of
la cercanía (grado de dispersión) entre una scatter) between a series of measurements
serie de medidas obtenidas de múltiples repe- obtained from multiple sampling of the same
ticiones de una muestra bajo las condiciones homogenous sample under the prescribed
de análisis establecidas. La exactitud describe conditions. The accuracy describes the degree
el grado de dispersión del valor obtenido res- of closeness of the determined value to the
pecto del valor nominal o conocido bajo las nominal or known true value under prescri-
9 9condiciones de análisis establecidas. . Para su bed conditions . The precision and accuracy
evaluación se prepararon 20 concentraciones of this method were evaluated using 20 con-
de glimepirida, por triplicado en el rango de centrations of analyte in plasma ranged 0.001
0.001 a 1.0 µg/mL más la adición de 0.25 µg/ to 1.0 µg/mL with addition glimepiride stan-
mL de glimepirida, y se determinaron cada dard 0.25 µg/mL (Table 4). For intra-day as-
una por triplicado. Las muestras fueron ana- say precision, 6 replicates at concentration 0.25
lizadas empleando la metodología descrita µg/mL of glimepiride were assayed all at once
(Tabla 4). Para el ensayo de precisión intra- within a day. The inter-day assay precision
día se realizaron 6 inyecciones de una con- was determined by analyzing the samples on
centración de 0.25 µg/mL of glimepirida. La two different days. Three replicates were as-
precisión inter-día se realizó analizando las sayed per day.
muestras en dos días distintos.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 411-427.MILENA PÉREZ G, GLORIA RAMÍREZ C, OMAR VELÁSQUEZ, MAURICIO PÉREZ F, PIEDAD RESTREPO V.420
TABLA 4.TABLA 4.TABLA 4. Precisión y exactitud de glimepirida. Resumen de estadísticas para relación de áreas.TABLA 4.TABLA 4.
TABLE 4.TABLE 4.TABLE TABLE 4.TABLE 4. 4. Precision and accuracy of glimepiride. Summary statistics for peak-area ratios.
Concentración n Promedio Varianza Desviación Mínimo Máximo Precisión Exactitud
Estándar
Concentration n Average Variance Standard Minimum Maximum Precision Accuracy
Deviation
1 9 0,536 0,00018 0,013 0,510 0,553 2,490 6,60
6 9 0,570 0,00527 0,073 0,495 0,668 12,730 11,47
12 3 0,577 0,00064 0,025 0,548 0,598 4,403 3,68
25 9 0,599 0,00058 0,024 0,575 0,638 4,033 4,83
35 9 0,638 0,00038 0,019 0,614 0,671 3,046 3,10
45 9 0,635 0,00169 0,041 0,538 0,684 6,483 5,81
55 9 0,779 0,00747 0,086 0,670 0,902 11,096 12,13
65 9 0,704 0,00011 0,010 0,693 0,721 1,488 2,24
75 9 0,746 0,00135 0,037 0,713 0,812 4,917 3,96
85 9 0,729 0,00024 0,015 0,713 0,759 2,114 4,84
100 9 1,000 0,10184 0,319 0,735 1,429 31,902 37,25
200 9 0,994 0,00221 0,047 0,921 1,045 4,728 3,95
300 9 1,165 0,00648 0,081 1,083 1,278 6,909 7,95
400 9 1,159 0,10084 0,318 0,769 1,526 27,402 22,69
500 9 1,439 0,07440 0,273 1,135 1,795 18,953 18,22
600 9 1,933 0,01552 0,125 1,653 2,043 6,446 4,67
700 9 2,562 0,73550 0,858 1,807 3,900 33,468 28,51
800 9 2,096 0,01876 0,137 1,927 2,255 6,535 12,65
900 9 2,868 0,37352 0,611 2,335 3,846 21,307 16,18
1000 9 2,923 0,00093 0,031 2,881 2,974 1,044 2,25
MEDIA 10,57 10,65
MEAN
Recuperación Recovery
La recuperación de un analito se refiere a The recovery of an analyte is the extrac-
la eficiencia de la extracción en un proceso tion efficiency of an analytical process, repor-
analítico. Se reporta como porcentaje de ana- ted as a percentage of the known amount of
10lito obtenido luego del proceso de extracción . an analyte carried through the sample extrac-
10Para su evaluación, se prepararon por triplica- tion and processing steps of the method .
do soluciones de glimepirida en plasma a Spiked plasma samples were prepared in tri-
concentraciones de 0.1, 0.5 y 1.0 µg/mL, y plicate at concentrations 0.1, 0.5 and 1.0 µg/
se analizaron siguiendo la metodología des- mL, and assayed and described above. Reco-
crita. La recuperación (eficiencia de la extrac- very (extraction efficacy) was calculated by
ción) se calculó mediante la comparación de comparing the peak-area of the extracted sam-
las relaciones de área de las muestras extraí- ple to that of the unextracted standard solu-
das y de los estándares no extraídos. tion containing the same concentration.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 411-427.

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