Etude In vitro de Phospholipases mycobactériennes impliquées dans la virulence, In vitro study of micobactérial Phospholipases involved in virulence

Jean-Claude Bakala N'Goma

Description

Sous la direction de Stéphane Canaan
Thèse soutenue le 26 mars 2010: Aix Marseille 2
Les phospholipases et en particulier les phospholipases C sont d'importants facteurs de virulence chez de nombreuses bactéries pathogènes (C. perfringens, B. Cereus et P. aeruginosa). Cependant, peu de choses sont connues sur l'implication de ces enzymes dans le processus de virulence des mycobactéries. Bien que l'étude des mutants des phospholipases C de M. tuberculosis dans un modèle d'infection chez la souris ait permis de proposer une implication de ces protéines dans la virulence de ce bacille, leurs propriétés biochimiques, leur mode d'action et leur rôle physiologique exact restent à élucider. Ce manque de données biochimiques sur les phospholipases mycobactériennes peuvent être attribuée à la difficulté à produire et à purifier des quantités importantes de ces enzymes. Dans le but de mieux caractériser le rôle physiologique des phospholipase mycobactériennes, l'objectif de ma thèse a été de mettre au point des conditions d'expression hétérologue permettant la production des phospholipases C mycobactériennes recombinantes (rPLC) dans différents systèmes d'expression (E. coli, Pichia pastoris et baculovirus/cellules d'insectes). Ces systèmes d'expression n'ayant pas donné des résultats satisfaisants, nous avons développé une méthode efficace d'expression de ces protéines en utilisant M. smegmatis.Ce système d'expression nous a permis de produire et de purifier les quate PLC (PLC-A, PLC-B, PLC-C et PLC-D) de M. tuberculosis et la PLC de M. Abscessus sous forme soluble et active. Nous avons pour la première fois montré que ces protéines purifiées avaient un effet cytotoxique sur les macrophages de souris en culture mais ne présentaient aucune activité hémolytique. en utilisant des marquages radioactifs, nous avons confirmé que l'effet cytotoxique observé était lité à l'hydrolyse des phospholipides des membranaires des cellules hôtes. Pour la première fois, nous avons pu confirmer que ces PLC sont directement impliquées dans le processus d'infection et de virulence.Un autre aspect de mon travail de thèse a concerné l'étude de deux autres protéines sécrétées par M. tuberculosis appartenant à la famille des cutinases : la Rv1984c et la Rv3452. Après les avoir produites et purifiées chez E. Coli, nouq avons montré que malgré ces deux protéines présentent 50% d'identité de séquence en acides aminés, elles ont des spécificités de substrat différentes et probablement un rôle physiologique différent. La Rv1984c est une lipase capacle d'hydrolyser des lipides à chaines moyennes, alors que la Rv3452 est une phospholipase de type A2 et est capable d'induire la lyse de macrophage de souris en culture.
-Mycobacterium tuberculosis
-Mycobacterium abscessus
-Mycobacterium smegmatis
-Phospholipase
-Lipase
-Cytotoxicité
-Macrophages
-Virulence
Phospholipases, particularly phospholipases C, are important virulence factors in several pathogenic bacteria (C. perfringens, B. cereus, L. monocytogenese and P. aeruginosa). However, little is know on the involvement of thses enzymes in mycobacteria pathogenesis. Although study on M. tuberculosis phospholipases C mutants in a mouse aerosol model of infection gave rise to the contribution of these proteins in virulence process, but their exact biochemical properties, mechanism of action and physiological role remain to be elucidated. This lack of data on mycobacterial phospholipases is mainly due to the difficulty to produce and purify these enzymes in large scale.With the aim to better characterise the physiological role of mycobacterial phospholipases, the main challenge of my thesis was to develop an efficient method for expression and purification of recombinant mycobacterial phospholipases C. Since no satisfactory results have been obtained with standard expression systems (E. coli, Pichia pastoris and baculovirus / insect cells), we develop a robust expression technique for these proteins using M. smegmatis as expression system.This allowed us to produce and purify all four PLC (PLC-A, PLC-B, PLC-C and PLC-D) of M. tuberculosis and the PLC of M. abscessus in soluble and active form. For the first time, we have show, that purified proteins have cytotoxic effect on mouse macrophages but have not haemolytic activity. Using radiolabelled lipids, we have confirmed that this first direct evidence that PLC are involved in infection and virulence processes. Another aspect of my thesis work concerned the study of two other secreted proteins of M. tuberculosis belonging to the cutinase family : the Rv 1984c ant the Rv3452. Recombinant proteins obtains in E. coli were found to have distinct substrate specificities and most likely distict physiological role, despite showing 50% amino acids sequence identity. Rv1984c is a lipase and is able to hydrolyse lipids with medium chains lengthn whereas Rv3452 is type A2, phospholipase and i able to induce macrophage lysis.
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22027/document

Sujets

• Mycobacterium tuberculosis
• Cytotoxicité
• Macrophage

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 180
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 26 Mo

Extrait

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
FACULTE DES SCIENCES DE LUMINY

THESE
Présentée et soutenue publiquement le 26 Mars 2010 par
Jean-Claude BAKALA N’GOMA
En vue de l’obtention du grade de
Docteur de l’Université de la Méditerranée
Spécialité : Microbiologie Moléculaire et Biotechnologies

Etude In vitro des Phospholipases mycobactériennes
impliquées dans la virulence


Composition du JURY

Examinateurs Rapporteurs
Professeur James Sturgis : Président Professeur Michel Lagarde
Professeur Jean Louis Hermann Docteur Roland Brosch
Docteur Christophe Guilhot
Docteur Stéphane Canaan : Directeur de thèse


Travaux réalisés au sein du Laboratoire « d’Enzymologie Interfaciale et de Physiologie de la Lipolyse »
UPR9025 CNRS Marseille





Remerciements
Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé dans le Laboratoire d’Enzymologie
Interfaciale et de Physiologie de la Lipolyse (EIPL) (UPR 9025) du CNRS Marseille, dirigé
par le Docteur Frédéric carrière, à qui je tiens à adresser ma profonde gratitude pour la
confiance qu’il m’a témoigné en acceptant de m’accueillir dans son laboratoire et pour m’avoir
permis de réaliser ce travail dans d’excellentes conditions scientifiques et matériels.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur James STurgis d’avoir
accepté de présider ce jury.
Je remercie sincèrement au Professeur Michel Lagarde et au Docteur Roland Brosch
d’avoir accepté de consacrer une partie de leur temps à juger ce travail de thèse en tant que
rapporteurs et membres du jury.
J’adresse aussi mes sincères remerciements au Professeur Jean-Louis Hermann et au
Docteur Christophe Guilhot qui m’ont fait l’honneur d’évaluer mon travail et de participer à
mon jury de thèse en tant qu’examinateur.
J’ai réalisé ma thèse dans de très bonnes conditions que je souhaite à tout étudiant, et
je garderai un excellent souvenir de tous les moments que j’ai passé à l’EIPL. Pour cela je
voudrais remercier plusieurs personnes.
Je souhaite tout d’abord exprimer ma profonde reconnaissance au Docteur Stéphane
Canaan, mon directeur de thèse qui a accepté de me recevoir dans son équipe de recherche et
de me proposer ce sujet de thèse. Je le remercie pour avoir cru en moi et surtout pour toute
l’énergie qu’il a déployée pour la résolution du problème rencontré lors de l’obtention de mon
visa d’entrée en France. Je tiens à lui adresser mes plus vifs remerciements pour m’avoir suivi
tout au long de ce travail. J’ai beaucoup apprécié ses conseils, son aide, ses encouragements
lors des moments difficiles que nous avons rencontrés dans la réalisation de ce travail, et des
discussions scientifiques enrichissantes que nous avons eues. J’ai beaucoup appris de sa
grande capacité à gérer, sur le plan humain et scientifique, les sujets de recherche dont il a la
charge.
Que le Docteur Robert Verger accepte de recevoir l’expression de ma profonde
gratitude pour toute l’attention qu’il a portée à mes travaux et pour toutes les discussions
scientifiques que nous avons pu avoir. J’ai bénéficié de sa grande culture scientifique et de son
enthousiasme pour la recherche.
Je tiens à rendre tout particulièrement hommage au Professeur Frédéric Guédé
Guina, Directeur du Laboratoire de Pharmacodynamie Biochimique et responsable de mon
DEA, qui n’est malheureusement plus de ce monde, pour ses enseignements et ses conseils. Je
remercie aussi tous mes enseignants de la faculté des Sciences d’Abidjan (Côte d’Ivoire) et de
Remerciements
la faculté des Sciences de Brazzaville (Congo) pour la qualité de la formation scientifique
qu’ils m’ont apportée. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
Merci au Docteur Carole serveau-Avesque et au Docteur Jean-François Cavalier
pour avoir accepté de consacrer du temps à corriger ce manuscrit.
Je tiens aussi à remercier le gouvernement congolais pour avoir financé cette thèse
sans lequel ce travail n’aurait pas vu le jour.
Je remercie tous mes collègues de l’équipe Canaan j’ai cité Damien Maurin, Rabeb
Dhouib, Mathieu Schué, Vincent Delorme, Luc Dedieu, avec qui j’ai travaillé dans une
bonne ambiance. Je remercie Sylvie Fernandez avec qui on a partagé le même bureau et qui a
animé les discussions dans une bonne ambiance bien que ne faisant pas partie de notre
équipe.
Merci aussi aux nombreux stagiaires qui sont passés et qui ont contribué à la vie de
cette équipe.
Je souhaiterais aussi remercier Sylvie Robert pour l’aide qu’elle a pu m’apporter dans
les manipulations de chromatographie en couche mince.
Je tiens à remercier aussi Thierry Dostes et Gregory Antoni pour leur aide précieuse
en informatique et leur sympathie.
J’ai une pensée pour les Docteurs Michèle Asther et Alain De Caro chercheurs à
l’EIPL qui ne sont plus parmi nous. Je leur rends hommage pour leurs conseils et pour leurs
qualités humaines irréprochables.
Je remercie tous les membres de l’EIPL pour leur soutien, leur gentillesse et leur bonne
humeur. Je remercie particulièrement Isabelle Douchet pour m’avoir assisté dans la
réalisation de mes premières expériences à l’EIPL. Je voudrais aussi remercier Sacha Molinari
l’homme à tout faire du labo, pour son sens de l’humour et pour les services rendus.
Merci à tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à l’aboutissement de ce travail
qui est le fruit d’une grande patience.
Pour finir je voudrais remercier du plus profond de mon cœur ma mère, mes sœurs et
frères et tous les autres membres de ma famille pour le soutien indéfectible qu’ils m’ont
apporté avant et tout au long de ma thèse.


Abréviations

Abréviations

AG Acide Gras
AP Acide Phosphatidique
ATCC "American Type Culture Collection"
ATS "American Thoracic Society"
BCG Bacille de Calmette et Guerin
BPF Bonnes Pratiques de Fabrication
BSA "Bovine Serum Albimine"
CD Cellules Dendritiques
CF "Cystic Fibrosis"
CFTR "Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator"
CIL Corps d’Inclusion Lipidique
CMC Concentration Micellaire Critique
CMH-I Complexe majeur d’Histocompatibilité de classe I
CMH-II Complexe majeur d’Histocompatibilité de classe II
CMI Concentrations Minimales Inhibitrices
CPA Cellules Présentatrices d’Antigènes
DAG Diacylglycérol
DAT 2,4-Diacyl-tréhalose
DC-SIGN "Dendritic Cell-Specific Intercellular aldhesion molecule -3-Grabbing Non-integrin"
DGL Diacylglycérol lipase
DIM Dimycocérosates de phthiocérol
DOTS "Directly Observed Treatment Short course"
DPPC Dipalmitoyl-Phosphorylcholine
DAPC 1-palmitoyl 2-Arachidonoyl-Phosphorylcholine
ECL "Enhanced chemilunescence
EMB Ethambutol
Erp "Exported repetitive protein"
FM "Foamy" macrophages
GPL Glycopeptidolipides
Icl Isocitrates lyases
IDR IntraDermoRéaction
Abréviations

IL-(x) Interleukine-(x)
INH Isoniazide
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside
ITL Infection Tuberculeuse Latente
LAM Lipoarabinomannane
LDH Lactate déshydrogénase
LLO Listeriolysin O
LM Lipomannane
LTC , D Leucotriènes C D 4 4 4, 4
MAC M. avium Complexe
MCL Mycobactéries à Croissance Lente
MCR Mycobactéries à Croissance Rapide
MDR "Multi Drug Resistant"
MMDAG Monoméromycolyldiacylglycerol
MNT Mycobactéries Non Tuberculeuses
MTP 5-Méthylthiopentose
NK "Natural Killer"
OMPLA "Outer Membrane Phospholipase A"
OMS Organisation Mondial de la Santé
PAF "Platelet-activating factor"
PAS Para-Amino Salicylique
PAT Polyacyltréhaloses
PC Phosphatidylcholine
PE Phosphatidyléthanolamine
PFO Perfringolysine O
PG Phosphatidylglycérol
PI Phosphatidylinositol
PIM Phosphatidylinositol Mannosides
PLA Phospholipase de type A 1 1
PLA Phospholipase de type A 2 2
PLC Phospholipase C
PLD Phospholipase D
p-NP para-nitrophénol
p-NPPC para-nitrophénylphosphorylcholine
Abréviations

PPD "Protein Purified Derivative"
PS Phosphatidylsérine
PZA Pyrazinamide
RM Récepteur au Mannose
RNI &q