OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE ARGENTINA Y ESPAÑA(DNA OBTENTION TO STUDY BLAD IN ARGENTINE AND SPANISH CATTLE)

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Resumen
Un nuevo método de extracción de muestras para análisis de DNA ha sido utilizado en 24 toros de la Cooperativa de Inseminación Artificial de Venado Tuerto, CIAVT, (Argentina) y en 10 toros del Centro de Selección y Reproducción Animal, CENSYRA, de Movera (España). En estos toros se estudia la Deficiencia de Adhesión Leucocitaria Bovina (BLAD). La enfermedad se debe a una mutación en la posición 488 del gen BOVCD18A o ITG2 (Shuster et al., 1992a) consistente en el cambio de una guanina por adenina, lo que produce el cambio del aminoácido ácido aspártico por glicina en la posición 128 de la cadena de la integrina 2, que en su forma mutada determina la incapacidad de emigración leucocitaria durante el proceso inflamatorio. El estudio se lleva a cabo mediante (PCR). Los fragmentos amplificados, se digieren con el enzima de restricción Taq I y se compara el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), respecto de controles positivos homocigotos y heterocigotos, así como también con controles negativos y un marcador de DNA como escala de referencia de tamaño. No se han encontrado portadores o enfermos de BLAD en ninguna de las poblaciones estudiadas.
Abstract
A new method was used to obtain DNA samples from bulls in Argentina and Spain from blood drops on cards. The genomic DNA obtained was analysed for Bovine Leukocyte Deficiency Syndrome (BLAD) using the polymerase chain reaction (PCR) on the BOVCD18A gene. The amplified fragments were digested by Taq I and separated by agarose gel electrophoresis along with a positive homozygote and heterozygote BLAD control, a negative control and a DNA size marker, to look for Restriction Fragment Polymorphisms (RFLP). None of the bulls had BLAD.
Fuente : pag: 505-508
Número de páginas: 4
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NOTA BREVE
OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE
ARGENTINA Y ESPAÑA
DNA OBTENTION TO STUDY BLAD IN ARGENTINE AND SPANISH CATTLE
2 1 1Schifferli, C., M. Villaroel y M.V. Arruga
1Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Facultad de Veterinaria. Miguel Servet, 177. 50013
Zaragoza. España.
2Departamento de Patología Animal. Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta Nacional 36 Km 601. 5800
Río Cuarto. Argentina.
PALABRAS CLAVE ADICIONALES ADDITIONAL KEYWORDS
Tarjetas. DNA. BLAD. PCR. RFLP. Enfermedades Cards. DNA extraction. BLAD. PCR. RFLP. Genetic
hereditarias. Inseminación artificial. diseases. Artificial Insemination.
RESUMEN
enfermos de BLAD en ninguna de las poblacio Un nuevo método de extracción de muestras
para análisis de DNA ha sido utilizado en 24 torosnes estudiadas.
de la Cooperativa de Inseminación Artificial de
Venado Tuerto, CIAVT, (Argentina) y en 10 toros
SUMMARYdel Centro de Selección y Reproducción Animal,
CENSYRA, de Movera (España). En estos toros
A new method was used to obtain DNAse estudia la Deficiencia de Adhesión Leucocitaria
Bovina (BLAD). La enfermedad se debe a una samples from bulls in Argentina and Spain from
blood drops on cards. The genomic DNA obtainedmutación en la posición 488 del gen BOVCD18A
o ITG2 (Shuster et al., 1992a) consistente en el was analysed for Bovine Leukocyte Deficiency
Syndrome (BLAD) using the polymerase chaincambio de una guanina por adenina, lo que
produce el cambio del aminoácido ácido aspártico reaction (PCR) on the BOVCD18A gene. The
amplified fragments were digested by Taq I andpor glicina en la posición 128 de la cadena de la
integrina 2, que en su forma mutada determina la separated by agarose gel electrophoresis along
with a positive homozygote and heterozygoteincapacidad de emigración leucocitaria durante
el proceso inflamatorio. El estudio se lleva a cabo BLAD control, a negative control and a DNA size
marker, to look for Restriction Fragment Polymor mediante (PCR). Los fragmentos amplificados,
se digieren con el enzima de restricción Taq I y phisms (RFLP). None of the bulls had BLAD.
se compara el polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP), respecto de
controles positivos homocigotos y heterocigotos, INTRODUCCIÓN
así como también con controles negativos y un
marcador de DNA como escala de referencia de Las tarjetas de muestras de sangre,
tamaño. No se han encontrado portadores o para extracción de DNA, muestran
Arch. Zootec. 49: 505 508. 2000.SCHIFFERLI, VILLAROEL Y ARRUGA
una clara ventaja frente a otros méto mutación es una sustitución de adenina
dos tradicionales: Ocupan un volumen por guanina en el nucleótido 488 del
mínimo, se conservan a temperatura cDNA, que lleva a la sustitución de
ambiente, es un sistema de remisión deaspartato por glicina en la posición
muestras fiable, barato y seguro, a 128. Así respecto a la mutación en la
diferencia de los actuales tubos de posición 128, son posibles tres genotipos
sangre. y dos fenotipos: D128/D128 (normal);
La Deficiencia de Adhesión Leuco D128G/D128G (enfermo, homocigoto)
citaria Bovina (BLAD), es una enfer y D128/D128G (portador hetero
medad hereditaria autosómica recesiva cigoto), ya que el alelo normal es domi
del bovino descrita en la raza Holstein,nante sobre el mutante que sólo causa
se presenta en terneros jóvenes con la enfermedad en estado homocigoto
neumonía recurrente, estomatitis (Shuster et al., 1992).
granulomatosa y ulcerativa, enteritis
con sobrecrecimiento bacteriano,
MATERIAL Y MÉTODOSperiodontitis, retraso en la curación de
heridas, neutrofilia persistente y muer
En este trabajo se tomaron mues te a temprana edad (Muller et al.,
tras de 10 toros del Centro de Selección1994; Gilbert et al., 1995).
y Reproducción Animal(CENSYRA), La BLAD se debe a una mutación
Movera (España) y de 24 toros de ladel gen BOVCD18, localizado en el
Cooperativa de Inseminación Artifi cromosoma 1, en la región q12 q14. Se
han descrito 2 mutaciones puntuales cial de Venado Tuerto (CIAVT), Ar
del gen del CD18. Una silenciosa en la gentina. Se extrae sangre (unas 8 o 10
base 880, de citosina a timina, corres gotas) que se colocan sobre la parte
pondiente al aminoácido 259 leucina, secante de la tarjeta. Se añaden 200 μl
que permanece inalterado. La otra de la solución FTA (Life Technologies).
Figura 1 y 2. Electroforesis en gel de agarosa de 10 toros del CENSYRA y controles
homocigoto y heterocigoto para BLAD. M es un marcador comercial de DNA de longitud
conocida. (Electrophoresis agarose gel of 10 CENSYRA bulls and homozygous and heterozygous to
BLAD. M is a known size DNA marker).
Archivos de zootecnia vol. 49, núm. 188, p. 506.OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN BOVINO
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de 24 toros de la CIAVT y controles homocigoto
y heterocigoto para BLAD. M es el marcador de DNA. (Electrophoresis agarose gel of 24 CIAVT
bulls and homozygous and heterozygous to BLAD. M is a known size DNA marker).
Se hacen tres lavados con la solucion verso: CCG ACT CGG TGA TGC
FTA. El último lavado se deja alrede CAT TGA, sintetizados por Pharmacia
dor de 6 horas. Retirar todo el agente Biotech, The Netherlands); 100
y añadir 200 μl de T.E. (Tris HCl nanogramos/ml de DNA genómico de
EDTA). Retirar el T.E. y dejar secar acada toro y de un control homocigoto y
temperatura ambiente. Se utiliza di heterocigoto para la BLAD.
rectamente en el mismo eppendorf para Las reacciones de PCR se realizan
50 μl de la reacción de PCR. en termociclador IHB 2024 (Cherlyn,
La amplificación del DNA en la Electronics) y se programan 3 ciclos
región de la mutación del nucleótido con 3 pasos: desnaturalización, unión y
488 del gen BOVCD18, se realiza me extensión de los cebadores. Después
diante la PCR descrita por Erlich et al. de la desnaturalización de 95°C duran
(1991) y Sammbrook et al. (1989) y se te 1 minuto, se realizan 40 ciclos de
optimizan el magnesio, la temperatura PCR (95°C x 1 min., 62°C x 1 min. y
y los tiempos de desnaturalización, 72°C x 1min.) y una extensión final de
unión y extensión de la PCR para 25 μl 72°C durante 5 minutos.
de mezcla: 0,25 U de Taq ADN La digestión de los productos de
polimerasa (Boehringer); 0,25 mM de amplificación se realiza a 62°C duran
dNTPs (Pharmacia); 2 mM de MgCl ; te 1 h con 2 U de Taq I (Boehringer)
2
50 mM de KCl; 10 mM de tris HCl; 0,5 que reconoce la secuencia nucleotídica
mM de cada cebador (directo: AGG TCGA e hidroliza entre T y C. Los
CAG TTG CGT TCA ACG TGA, re productos de digestión se separan en
Archivos de zootecnia vol. 49, núm. 188, p. 507.SCHIFFERLI, VILLAROEL Y ARRUGA
gel de agarosa (Boehringer) al 2,5 dor del DNA de tamaño conocido.
p.100, junto a un marcador de ADN de No se ha detectado ningún indivi
talla conocida. duo portador de la BLAD en la pobla
ción de toros estudiada de la CIAVT,
Argentina como tampoco en el grupo
RESULTADOS Y DISCUSIÓN de toros estudiados del CENSYRA,
Movera, España.
En las figuras 1 y 2, se ilustran las En Argentina, Poli et al. (1996),
electroforesis en gel de agarosa de los sobre un total de 104 toros Holstein
10 toros del CENSYRA, junto a los procedentes de 5 centros de insemina
controles homocigoto y heterocigoto ción artificial, determinan una preva
de la BLAD y un marcador del DNA lencia de 2,8 p.100 de portadores
de talla conocida. heterocigotos.
En la figura 3, se muestra la elec Aunque la prevalencia determina
troforesis de los fragmentos digeridos da en Argentina es baja, se justifica
con Taq I de los 24 toros de la CIAVT, plenamente seguir realizando estos es
junto a los controles homocigoto y tudios en animales con alto valor e
heterocigoto de la BLAD y un marca- impacto reproductivo.
BIBLIOGRAFÍA
Erlich, H.A., D. Gelfand and J.J. Sninsky. 1991. clinical course and laboratory findings in
Recent advances in the polymerase chain eight affected animals. Vet. Quarterly, 16:
65 71.reaction. Science, 252: 1643 1651.
Gilbert, R., W. Rebhun, C. Kim, M. Hehrli, D. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis.
1989. Molecular cloning. A laboratory ma Shuster and M. Ackermann. 1995. Clinical
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J. A. V. M. A. , 202: 445 449. R.O. Gilbert. 1992. Identification and pre
valence of a genetic defect that causesMuller, K., W. Bernardina, H. Kalsbeek, A.
Hoek, V. Rutten and G. Wentink. 1994. leukocyte adhesion deficiency in Holstein
cattle. Proc. Nat. Acad.Sc. , 89: 9225 9229.Bovine leukocyte adhesion deficiency
Recibido: 28 09 00. Aceptado: 5 10 00.
Archivos de zootecnia vol. 49, núm. 188, p. 508.

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