Estudio de la influencia de los factores de polimerización en la formación de nanopartículas de polibutil- cianoacrilato y la cinética de liberación de fármaco in vitro (Study of influence of polymerization factors on formation of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles and in vitro drug release kinetics)

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Resumen
Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato se sintetizaron mediante polimerización por dispersión y se caracterizaron mediante espectroscopía 1H-NMR, calorimetría diferencial de barrido y microscopía electrónica de transmisión.
Se estudiaron propiedades de las partículas tales como el tamaño y el potencial zeta, y la influencia de la
concentración y el tipo de estabilizador en el tamaño de las partículas. También se estudió la influencia de factores de polimerización tales como la concentración de monómero, la temperatura y el tiempo de polimerización en el tamaño y la distribución de las partículas, y su efecto en la eficacia de captura de las nanopartículas, utilizando clorhidrato de doxorubicina (DH) como fármaco modelo. Las concentraciones elevadas de monómero dieron lugar a la formación de partículas de mayor tamaño con distribución de tamaño bimodal y amplia y aumentaron la captura del fármaco. La polimerización a baja temperatura dio lugar a la formación de partículas más pequeñas, mientras que a temperatura elevada (60 °C) se produjo aglomeración y se redujo la captura del fármaco. Los tiempos de polimerización elevados no mostraron tener mucha influencia en el tamaño de las partículas, pero aumentaron la captura del fármaco. Se realizó la carga del fármaco en las nanopartículas mediante técnicas de incorporación y adsorción y se determinó la captura del fármaco. Las nanopartículas cargadas mediante técnicas de incorporación y adsorción mostraron una liberación rápida de fármaco en 0,001 N HCl. La liberación de fármaco en ambos tipos de nanopartículas siguió la ecuación de Higuchi. También se intentó establecer una correlación crítica entre las propiedades de las partículas y el comportamiento de la liberación de fármaco, así como subrayar su importancia en diversas facetas de la administración de fármaco.
Abstract
Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles were synthesized by dispersion polymerization and characterized by 1H-NMR spectroscopy, differential scanning calorimetry and transmission electron microscopy. Particle properties such as zeta potential and size, and the influence of concentration and type of stabilizer on particle size were studied. The influence of polymerization factors such as monomer concentration, polymerization time and temperature on the particle size and distribution, and their effect on entrapment efficiency of the nanoparticles was studied, using doxorubicin hydrochloride (DH) as a model drug. High monomer concentrations lead to the formation of larger particles with broad and bimodal size distribution, and increased the drug entrapment. Polymerization at low temperatures resulted in smaller particles, and agglomeration was found at high temperature (60°C), with reduced drug entrapment. High polymerization times did not show much influence on particle size, but increased the drug entrapment. Drug loading into nanoparticles wascarried out by incorporation and adsorption techniques, and drug entrapment was determined. The nanoparticles loaded
by incorporation and adsorption techniques showed rapid drug release in 0.001N HCl. Drug release from both types of nanoparticles followed Higuchi equation. An attempt was also made to critically correlate the particle properties and drug release behavior and emphasize its importance in various facets of drug delivery.
Publicado el : jueves, 01 de enero de 2004
Lectura(s) : 96
Fuente : Ars Pharmaceutica 0004-2927 2004 Volumen 45 Número 3
Número de páginas: 24
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ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES DE POLIMERIZACIÓN EN LA FORMACIÓN DE NANOPARTÍCULAS... 211TRABAJOS ORIGINALES
ORIGINAL WORKS
Estudio de la influencia de los factores
de polimerización en la formación
de nanopartículas de polibutil-cianoacrilato
y la cinética de liberación de fármaco in vitro
Study of influence of polymerization factors on formation of poly(butyl
cyanoacrylate) nanoparticles and in vitro drug release kinetics
HARIVARDHAN-REDDY L, MURTHY RSR*
Drug delivery research laboratory, Center of relevance and excellence in NDDS, Pharmacy Department, G.H.
Patel building, M.S. University of Baroda, Vadodara-390002, Gujarat, India.
*Autor de contacto: Teléfono: (0265) 2434187/2794051. Fax: (0265) 2418928
Correo electrónico: m_rsr@rediffmail.com
RESUMEN
Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato se sintetizaron mediante polimerización por dispersión y se caracteri-
1zaron mediante espectroscopía H-NMR, calorimetría diferencial de barrido y microscopía electrónica de transmi-
sión. Se estudiaron propiedades de las partículas tales como el tamaño y el potencial zeta, y la influencia de la
concentración y el tipo de estabilizador en el tamaño de las partículas. También se estudió la influencia de factores
de polimerización tales como la concentración de monómero, la temperatura y el tiempo de polimerización en el
tamaño y la distribución de las partículas, y su efecto en la eficacia de captura de las nanopartículas, utilizando
clorhidrato de doxorubicina (DH) como fármaco modelo. Las concentraciones elevadas de monómero dieron lugar
a la formación de partículas de mayor tamaño con distribución de tamaño bimodal y amplia y aumentaron la
captura del fármaco. La polimerización a baja temperatura dio lugar a la formación de partículas más pequeñas,
mientras que a temperatura elevada (60 °C) se produjo aglomeración y se redujo la captura del fármaco. Los
tiempos de polimerización elevados no mostraron tener mucha influencia en el tamaño de las partículas, pero
aumentaron la captura del fármaco. Se realizó la carga del fármaco en las nanopartículas mediante técnicas de
incorporación y adsorción y se determinó la captura del fármaco. Las nanopartículas cargadas mediante técnicas de
incorporación y adsorción mostraron una liberación rápida de fármaco en 0,001 N HCl. La liberación de fármaco
en ambos tipos de nanopartículas siguió la ecuación de Higuchi. También se intentó establecer una correlación crítica
entre las propiedades de las partículas y el comportamiento de la liberación de fármaco, así como subrayar su
importancia en diversas facetas de la administración de fármaco.
PALABRAS CLAVE: Polibutil-cianoacrilato. Nanopartícula. Doxorubicina. Polimerización. Captura de fármaco. Libera-
ción de fármaco.
ABSTRACT
1Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles were synthesized by dispersion polymerization and characterized by H-NMR
spectroscopy, differential scanning calorimetry and transmission electron microscopy. Particle properties such as zeta
potential and size, and the influence of concentration and type of stabilizer on particle size were studied. The influence
of polymerization factors such as monomer concentration, polymerization time and temperature on the particle size and
distribution, and their effect on entrapment efficiency of the nanoparticles was studied, using doxorubicin hydrochloride
(DH) as a model drug. High monomer concentrations lead to the formation of larger particles with broad and bimodal
size distribution, and increased the drug entrapment. Polymerization at low temperatures resulted in smaller particles,
and agglomeration was found at high temperature (60°C), with reduced drug entrapment. High polymerization times did
not show much influence on particle size, but increased the drug entrapment. Drug loading into nanoparticles was
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carried out by incorporation and adsorption techniques, and drug entrapment was determined. The nanoparticles loaded
by incorporation and adsorption techniques showed rapid drug release in 0.001N HCl. Drug release from both types of
nanoparticles followed Higuchi equation. An attempt was also made to critically correlate the particle properties and
drug release behavior and emphasize its importance in various facets of drug delivery.
KEY WORDS: Poly(butyl cyanoacrylate). Nanoparticle. Doxorubicin. Polymerization. Drug entrapment. Drug release.
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
El desarrollo de sistemas de transporte coloi- Development of colloidal carrier systems has
dales no ha constituido un área de gran interés now been an area of great interest in the field of
en el campo de la administración de fármacos. drug delivery. Amongst these carriers, polyme-
Las nanopartículas poliméricas son los sistemas ric nanoparticles are the most extensively inves-
de transporte que se han investigado en mayor tigated. Poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticles
profundidad. Las nanopartículas de polialkil-cia- have recently gained increasing interest in targe-
noacrilato han empezado a suscitar recientemen- ting and drug delivery, because of the ease of
te un creciente interés en el ámbito de la admi- synthesis, biodegradability, ability to alter bio-
1-5nistración de fármacos dirigida debido a su distribution of drugs and lower toxicity. Anio-
facilidad de síntesis, biodegradabilidad, capaci- nic polymerization of alkyl cyanoacrylate mono-
dad para alterar la biodistribución de los fárma- mers in aqueous acidic media containing a
1-5cos y reducida toxicidad. La polimerización stabilizer leads to the formation of nanoparticles
1,6aniónica de los monómeros de alkil cianoacrila- with high porosity and smooth surface. The
to en un medio acuoso acídico con un estabiliza- experimental parameters such as pH and tempe-
dor da lugar a la formación de nanopartículas de rature were reported to have greater influence on
1,6 7 Los pará- the properties of particles formed. Polymeriza-elevada porosidad y superficie lisa.
metros experimentales como el pH y la tempera- tion at low pH favor nanoparticle formation, but
tura demostraron tener una mayor influencia en pH > 3.5 leads to rapid polymer formation resul-
7las propiedades de las partículas sintetizadas. ting in larger aggregates rather than nanoparti-
7La polimerización con un pH bajo favorece la Drug containing nanoparticles can be pre-cles.
formación de nanopartículas, mientras que un pH pared either by dissolving drug in polymerization
superior a 3,5 acelera la síntesis de polímeros y medium prior to the monomer addition, or by
da lugar a la formación de agregados de mayor adsorption of drug on the preformed nanoparti-
7tamaño. La preparación de nanopartículas que cle surface. Several reports were published on
polyalkyl cyanoacrylate nanoparticles regardingcontienen un fármaco se puede realizar mediante
5, 8-10 11incorporation of various drugs , stability ,la disolución del fármaco en un medio de poli-
1 12merización antes de la adición de monómero o toxicity and biodistribution. But a little atten-
mediante la adsorción del fármaco en la superfi- tion has been given to study clearly the influen-
cie de la nanopartícula previamente sintetizada. ce of polymerization factors on the particle pro-
Se han publicado varios estudios sobre las nano- perties, and their effect on entrapment efficiency
partículas de polialkil-cianoacrilato relacionados of nanoparticles to obtain an optimized formula-
5, 8-10con la incorporación de diversos fármacos , tion. In view of applicability, the particle pro-
11 1 12la estabilidad , la toxicidad y la biodistribución. perties such as size, size distribution and surface
Sin embargo, se ha prestado poca atención al characteristics have great importance especially
13, as they influenceestudio de la influencia real de los factores de for targeted drug delivery
the biodistribution of nanoparticles.polimerización en las propiedades de las partí-
culas y su efecto en la eficacia de captura de las Doxorubicin hydrochloride (DH) is an an-
nanopartículas para la obtención de una formu- tineoplastic anthracycline antibiotic widely used
lación optimizada. Respecto a las posibilidades in the treatment of acute lymphoblastic leuke-
de aplicación, las propiedades de las partículas mia, acute myeloblastic leukemia, malignant lym-
phoma, hodgkin’s disease and breast carcinoma.tales como el tamaño, la distribución de tamaño
y las características de la superficie tienen una The anthracycline ring is lipophilic, and the
gran importancia, especialmente para la admi- molecule is amphoteric having acidic functions
nistración de fármacos dirigida, ya que influyen in the ring phenolic groups and a basic function
en la biodistribución de las nanopartículas. in the sugar amino group. DH causes cytotoxici-
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El clorhidrato de doxorubicina (DH) es un ty by specific intercalation of planar anthracycli-
14antibiótico de antraciclina antineoplástico amplia- ne nucleus with the DNA double helix.
Poly(butyl cyanoacrylate) (PBC) nanopar-mente utilizado en el tratamiento de la leucemia
linfoblástica aguda, la leucemia mieloblástica ticles containing doxorubicin could be one of
aguda, los linfomas malignos, la enfermedad de the potential carriers for drug delivery, because
Hodgkin y el carcinoma mamario. El anillo de of their biodegradability and surface properties
antraciclina es lipofílico y la molécula es anfo- (negative charge). These systems could be effec-
térica, con funciones acídicas en los grupos fe- tively used in the chemotherapy of cancer espe-
nólicos del anillo y una función básica en el grupo cially in peritoneal carcinomatosis and lympha-
de aminoazúcares. El DH causa citotoxicidad tic carcinomas. The particle properties being
mediante la intercalación específica del núcleo considerably important in such applications, the
de la antraciclina planar con la doble hélice del present communication reports a detailed study
14ADN. of the effect of polymerization factors such as
Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato monomer concentration, polymerization tempe-
(PBC) que contienen doxorubicina pueden ser rature and time on particle size and distribution,
uno de los posibles sistemas de transporte para and influence of these parameters on entrapment
la administración de fármacos, debido a su bio- efficiency of nanoparticles. The effect of stabi-
degradabilidad y a las propiedades de su super- lizer type and concentration on particle size and
distribution was investigated. Kinetics of drugficie (carga negativa). Estos sistemas se pueden
utilizar eficazmente en la quimioterapia del cán- release from nanoparticles prepared by incorpo-
cer, especialmente en los casos de carcinomato- ration and adsorption of drug was also studied.
sis peritoneal y carcinomas linfáticos. Partiendo
de la considerable importancia de las propieda-
des de las partículas en tales aplicaciones, en MATERIALS
este informe se presenta un estudio detallado del
efecto de factores de polimerización tales como n-butyl cyanoacrylate monomer was gifted by
la concentración de monómero, el tiempo y la Sun Pharmaceutical Industries Limited (India),
temperatura de polimerización en la distribución Dextran 40 (molecular weight 40,000) and Dex-
y el tamaño de las partículas, y la influencia de tran 70 (molecular weight 70,000) were gift sam-
estos parámetros en la eficacia de captura de las ples from Claris life sciences limited (India).
nanopartículas. Se investigó el efecto del tipo de Dextran sulfate was obtained from Hi-media (In-
estabilizador y de su concentración en el tamaño dia). Doxorubicin hydrochloride was a gift sam-
y la distribución de las partículas. También se ple from RPG life sciences (India). All other
estudió la cinética de liberación de fármaco de chemicals and reagents used in the study were of
las nanopartículas preparadas mediante incorpo- analytical grade. Water used in the study was
ración y adsorción de fármaco. distilled and filtered through 0.22 µm filter (Pall,
India) before use.
MATERIALES
METHODS
el monómero de n-butil cianoacrilato fue pro-
porcionado gratuitamente por Sun Pharmaceuti- Synthesis of poly(butyl cyanoacrylate) (PBC)
cal Industries Limited (India), las muestras de nanoparticles:
dextran 40 (peso molecular 40.000) y dextran 70
(peso molecular 70,000) fueron proporcionadas Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles were
también de forma gratuita por Claris life scien- prepared by dispersion polymerization by slight
11ces limited (India). El sulfato de dextran se ob- modification of the previously reported method.
tuvo de Hi-media (India). La muestra de clorhi- Briefly, monomer was added drop-wise into the
drato de doxorubicina fue proporcionada acidic medium (0.001N HCl) containing dextran
gratuitamente por RPG life sciences (India). Todos 70 under controlled stirring at 700 RPM. Po-
los demás productos químicos y reactivos utili- lymerization was continued for 3h, after which
zados en el estudio eran de grado analítico. El the nanoparticle dispersion was neutralized to pH
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agua utilizada en el estudio era agua destilada y 7.0 with 7.4 pH phosphate buffer containing NaOH
filtrada a través de un filtro de 0,22 µ (Pall, India) (7.4 pH PB), and stirring was continued for 1h
to allow complete polymerization.antes de su uso.
MÉTODOS Synthesis of doxorubicin loaded poly(butyl
cyanoacrylate) nanoparticles (DPBC)
Síntesis de nanopartículas de polibutil-
DPBC nanoparticles were prepared similar tocianoacrilato (PBC):
PBC nanoparticles. DH and dextran 70 were
dissolved in 0.001N HCl, and monomer was slo-Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato
wly added drop-wise into the polymerizationse prepararon mediante polimerización por dis-
medium, under continuous stirring at 700 RPM.persión con una ligera modificación respecto al
11 After 3h of polymerization, the dispersion wasmétodo empleado anteriormente. En síntesis, el
neutralized to pH 7.0 with 7.4 pH PB, and sti-monómero se añadió mediante goteo al medio
rring was continued for 1h to allow completeacídico (0,001 N HCl) que contenía dextran 70
polymerization.removiendo de forma controlada a 700 rpm. La
polimerización continuó durante 3 horas, trans-
curridas las cuales se neutralizó la dispersión de
Estimation of doxorubicin in DPBC nanoparticles:nanopartículas hasta un pH de 7,0 mediante un
tampón de fosfato (pH 7,4) con NaOH y se si-
guió removiendo durante 1 hora para obtener una The nanoparticulate dispersion was centrifu-
ged at 15000 RPM for 30 min in a cooling cen-polimerización completa.
trifuge (Remi C24, Remi instruments, India). The
supernatant was decanted and sediment was
washed thrice with distilled water to separate theSíntesis de nanopartículas de polibutil-
cianoacrilato cargadas con doxorubicina (DPBC) free drug from nanoparticles, and lyophilized.
The lyophilized nanoparticles were weighed and
dissolved in methanol, and the solutions wereLa preparación de las nanopartículas de DPBC
analyzed in UV-Visible spectrophotometer (Hi-fue similar a la de las nanopartículas de PBC. Se
tachi U 2000, Japan) at 495 nm.disolvieron DH y dextran 70 en 0,001 N HCl y
se añadió lentamente el monómero mediante goteo
al medio de polimerización removiendo de for-
Characterization of nanoparticlesma constante a 700 rpm. Después de 3 horas de
polimerización, la dispersión se neutralizó hasta
1H-NMR spectroscopyun pH de 7,0 mediante un tampón de fosfato de
pH 7,4 y se siguió removiendo durante 1 hora
1H-NMR spectrum of PBC nanoparticles waspara obtener una polimerización completa.
recorded on FT-NMR Avance 400 MHz Fourier
transform nuclear magnetic resonance spectro-
meter (Bruker-Biospin, AG, Switzerland). TheEstimación de doxorubicina en las nanopartículas
de DPBC: nanoparticles were dissolved in chloroform-
(Merck, Germany) and transferred to a 5 mmd1
NMR tube. The sample was spinned at 20 RPSLa dispersión de nanopartículas se centrifugó
at a power level of –4.0db, and pulse length ofa 15.000 rpm durante 30 minutos en un centrifu-
5 µs, with a delay time of 10 s. NMR tube con-gador por enfriamiento (Remi C24, Remi instru-
ments, India). Se decantó el sobrenadante y el taining sample was placed in 5 mm broad band
probe head, and pulse programming was perfor-sedimento se lavó tres veces con agua destilada
med at Zg (zero go) with sweep width of 18para separar el fármaco libre de las nanopartícu-
ppm. The spectrum of sample was recorded afterlas y se liofilizó. Las nanopartículas liofilizadas
carrying out 32 scans.se pesaron y se disolvieron en metanol, y se
analizaron las soluciones en un espectrofotóme-
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tro UV-Visible (Hitachi U 2000, Japón) a 495 Differential scanning calorimetry (DSC)
nm.
DSC analysis of the nanoparticles was carried
out in Mettler Toledo differential scanning calo-
Caracterización de las nanopartículas rimeter (Mettler Toledo, Switzerland) at a hea-
ting rate of 10°C per minute in the range of 50°C
1Espectroscopía H-NMR to 350°C.
1El espectro H-NMR de las nanopartículas de
PBC se registró en un espectrómetro de resonan- Transmission electron microscopy (TEM)
cia magnética nuclear FT-NMR Avance Fourier
Transform de 400 MHz (Bruker-Biospin, AG, TEM studies were performed in Philips Te-
Suiza). Las nanopartículas se disolvieron en clo- chnai-20 transmission electron microscope. Na-
(Merck, Alemania) y se transfirieronroformo-d noparticles were dispersed in de-ionized disti-1
a un tubo de RMN de 5 mm. La muestra se lled water and one drop of the diluted dispersion
centrifugó a 20 rps a un nivel de potencia de – was placed on 200-mesh carbon coated copper
4,0 db, con una longitud de pulso de 5 µs y un grid. 2% uranyl acetate was used as staining agent
tiempo de demora de 10 s. El tubo de RMN que for nanoparticles.
contenía la muestra se colocó en una cabeza de
sonda de banda ancha de 5 mm y se realizó una
programación del pulso con paso por cero con Particle size measurement
un ancho de barrido de 18 ppm. El espectro de
la muestra se registró después de 32 barridos. Particle size measurement was carried out by
laser scattering using Malvern Hydro 2000 SM
particle size analyzer (Malvern instruments, UK).
Calorimetría diferencial de barrido (CDB) Aqueous nanoparticulate dispersion was added
to the sample dispersion unit containing stirrer
Los análisis mediante CDB de las nanopartí- and stirred in order to minimize the inter particle
culas se realizaron en un calorímetro diferencial interactions, and laser obscuration range was
de barrido (Mettler Toledo, Suiza) con una velo- maintained between 10-20%. The analysis was
cidad de calentamiento de 10 °C por minuto en performed thrice and average values were taken.
un rango comprendido entre 50 y 350 °C. The number of particles (Np) was calculated
15,by the following equation
3N = 6 M X / π ρ D .p o m n
Microscopía electrónica de transmisión (MET) Where D is a number average diameter of then
polymer particles obtained from dynamic light
is fractional conversion, M is amountLos estudios de MET se realizaron con el scattering, Xm o
3of monomer charged in g/cm into the polymeri-microscopio electrónico de transmisión Philips
Technai-20. Las nanopartículas se dispersaron en zation medium, ρ is the density of the polymer in
3 3agua destilada desionizada y se colocó una gota g/cm and N is number of particles/cm .p
de la dispersión diluida en una rejilla de cobre
con una película de carbono de 200 mesh. Se
Zeta potential measurementutilizó un 2% de uranil-acetato para teñir las
nanopartículas.
Zeta potential of nanoparticles was measured
(Malvern Instru-in Malvern Zetasizer 3000 HSA
ments, UK). The aqueous nanoparticulate dis-Medición del tamaño de las partículas
persion was diluted in various media such as
La medición del tamaño de las partículas se 0.001 N HCl, 0.9% saline, 7.4 pH phosphate buffer
realizó por dispersión de luz dinámica utilizando and 8.0 pH tris buffer, and the zeta potential was
measured.el analizador de tamaño de partículas Malvern
Hydro 2000 SM (Malvern instruments, RU). La
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dispersión acuosa de nanopartículas se añadió a Drug adsorption to PBC nanoparticles
la unidad de dispersión de la muestra que conte-
nía un agitador y se removió para minimizar las Adsorption of DH to PBC nanoparticles was
interacciones entre las partículas, manteniendo studied at various pH such as 3.0, 5.0, 7.0 and
un intervalo de oscurecimiento de láser compren- 8.0. PBC nanoparticles were synthesized, and the
dido entre el 10 y el 20%. El análisis se realizó dispersions were adjusted to different pH with
tres veces y se consideraron los valores medios. 0.1N NaOH solution. Aqueous solution of DH
El número de partículas (Np) se calculó me- was then added to the dispersions under stirring,
15diante la siguiente ecuación : and incubated at 37 ± 2°C for predetermined
3N = 6 M X / π ρ D . time intervals. After incubation period, the dis-
p o m n
Donde D es el valor medio del diámetro de persions were centrifuged and supernatant wasn
las partículas de polímero obtenido mediante decanted. The sediment was re-dispersed in dis-
es una conver-dispersión de luz dinámica, X tilled water and lyophilized. The lyophilizate wasm
sión fraccional, M es la cantidad de monómero weighed and dissolved in methanol, and solutio-o
cargada en el medio de polimerización medida ns were analyzed for drug content in UV-Visible
3 3en g/cm , ρ es la densidad del polímero en g/cm spectrophotometer (Hitachi U 2000, Japan) at 495
3y N es el número de nanopartículas por cm . nm.p
Medición del potencial zeta Drug release from DPBC nanoparticles
La determinación del potencial zeta de las Release of DH from DPBC nanoparticles was
nanopartículas se realizó con un equipo Malvern performed in 0.001N HCl and 0.9% saline. Dialysis
(Malvern Instruments, RU).Zetasizer 3000 HS bag technique was used for the release study asA
8La dispersión acuosa de nanopartículas se diluyó reported by Marchal-Heussler et al. The aqueous
en varios medios (0,001 N HCl, solución salina nanoparticulate dispersion was placed in cellulo-
al 0,9 %, tampón de fosfato de pH 7,4 y tampón se dialysis bag (Hi-Media, cutoff 5000) and is
sealed at both ends. The dialysis bag was dippedtris de pH 8,0) y se midió el potencial zeta.
in the receptor compartment containing dissolu-
tion medium, which was stirred continuously at
Adsorción de fármaco en las nanopartículas de 100 rpm maintained at 37 ± 2°C. The receptor
PBC compartment was closed to prevent evaporation
of dissolution medium. Samples were withdrawn
Se estudió la adsorción de DH en las nano- at regular time intervals and the same volume
partículas de PBC a varios pH (3,0, 5,0, 7,0 y was replaced by fresh dissolution medium. The
8,0). Se sintetizaron las nanopartículas de PBC y samples were analyzed in UV-Visible spectro-
se ajustó el pH de las dispersiones con una so- photometer at 495 nm. All experiments were
repeated thrice and the average values were taken.lución de 0,1 N NaOH. A continuación, la solu-
ción acuosa de DH se añadió a las dispersiones
removiendo simultáneamente y se incubó a una
temperatura de 37 ± 2 °C durante intervalos de RESULTS AND DISCUSSION
tiempo predeterminados. Una vez finalizado el
período de incubación, se centrifugaron las dis- Synthesis and mechanism of formation of PBC
persiones y se decantó el sobrenadante. El sedi- nanoparticles:
mento se volvió a dispersar en agua destilada y
se liofilizó. El liofilizado se pesó y se disolvió PBC nanoparticles were synthesized by dis-
en metanol, y se calculó el contenido de fármaco persion polymerization of n-butyl cyanoacrylate
de las soluciones en un espectrofotómetro UV- by slow and drop-wise addition of monomer into
Visible (Hitachi U 2000, Japón) a 495 nm. the polymerization medium containing stabilizer.
The mechanistic events involved in the polyme-
rization are discussed here. Controlled concen-
tration of hydroxyl ions present in the medium,
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Liberación de fármaco de las nanopartículas de initiate monomeric units to form oligomers. These
DPBC oligomers further propagate, increase in chain
length and experience reduced solubility in the
La liberación de DH de las nanopartículas de aqueous phase after attaining a critical chain length,
DPBC se realizó en 0,001 N HCl y solución salina then precipitate out from aqueous phase to form
al 0,9%. Para el estudio de la liberación se uti- primary particles (termed as homogeneous nu-
lizó la técnica de la bolsa de diálisis referida por cleation). The monomer diffuses from dispersed
8 La dispersión acuosa deMarchal-Heussler et al. droplets into the primary particles leading to the
nanopartículas se colocó en una bolsa de diálisis formation of swollen structures. Monomer in the
de celulosa (Hi-Media, máximo 5000) y se selló swollen primary particles further gets polymeri-
por ambos lados. La bolsa de diálisis se introdu- zed by ion entry and its propagation resulting in
jo en un compartimento receptor que contenía particle growth, which continues till all the
un medio de disolución, que se removió conti- monomer droplets are utilized. At this stage, the
nuamente a 100 rpm y se mantuvo a una tempe- stabilizer covers particle surface and causes sta-
ratura de 37 ± 2 °C. El compartimento receptor bilization by steric repulsion mechanism.
se cerró para evitar la evaporación del medio de
disolución. Las muestras se fueron retirando a
intervalos de tiempo regulares y el volumen re- Characterization of nanoparticles
tirado se sustituyó por un medio de disolución
1fresco. Las muestras se analizaron en el espec- PBC nanoparticles were characterized by H-
trofotómetro UV-Visible a 495 nm. Todos los NMR spectroscopy [Figure 1]. The results obtai-
experimentos se repitieron tres veces y se consi- ned were tabulated (Table 1) indicating the peak
position, peak multiplicity and number of pro-deraron los valores medios.
tons. The spectrum confirms the presence of all
functional groups of polymer and its complete
formation.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figure 2 shows DSC thermograms of both
PBC and DPBC nanoparticles. PBC nanoparti-Síntesis y mecanismo de formación de las
cles showed glass transition temperature (Tg) atnanopartículas de PBC:
192.9°C, and a ∆H value of 1230 mJ. DPBC
nanoparticles showed Tg at 189.7°C and ∆H valueLas nanopartículas de PBC se sintetizaron
of 1546 mJ.mediante polimerización por dispersión de n-butil
Table 2 shows the zeta potential of PBC andcianoacrilato añadiendo lentamente monómero
DPBC nanoparticles in four different media suchmediante goteo al medio de polimerización que
as 0.001N HCl, 0.9% saline, 7.4 pH phosphatecontenía el estabilizador. En esta sección se tra-
buffer and 8.0 pH tris buffer. Zeta potential oftarán los aspectos mecanicistas implicados en el
both PBC and DPBC nanoparticles increased withproceso de la polimerización. La concentración
increase in pH, being high in 8.0 pH tris buffercontrolada de los iones hidróxilos presentes en
and low in 0.001N HCl. The results obtainedel medio hace que las unidades monoméricas
were in accordance with that reported by Mullerempiecen a formar oligómeros. Estos oligóme-
16et al. for alkyl cyanoacrylates such as polyme-ros se van propagando y la longitud de sus cade-
thyl, polyethyl, polyisobutyl and polyisohexylnas aumenta hasta alcanzar un nivel crítico a
nanoparticles. This trend is due to increase inpartir del cual se produce una reducción de la
degree of dissociation of free acrylic acid groupssolubilidad de los oligómeros y éstos salen de la
of polymer with increase in pH, being low atfase acuosa para formar partículas primarias (pro-
low pH values. At the same time, the contribu-ceso de nucleación homogénea). Las gotitas dis-
tion of dextran in observed high zeta potentialpersas de monómero migran a las partículas pri-
values of nanoparticles due to its dissociation inmarias dando lugar a la formación de estructuras
aqueous medium cannot be ruled out.hinchadas. El monómero de las partículas pri-
marias hinchadas continúa su proceso de poli-
merización mediante la entrada y propagación
de iones que produce un crecimiento de la par-
Ars Pharmaceutica, 45:3; 211-234, 2004HARIVARDHAN-REDDY L, MURTHY RSR.218
tícula que continúa hasta que se han utilizado
todas las gotitas de monómero. En esta fase, el
estabilizador cubre la superficie de la partícula y
causa una estabilización mediante un mecanis-
mo de repulsión estérica.
Caracterización de las nanopartículas
Las nanopartículas de PBC se caracterizaron
1mediante espectroscopía H-NMR [Figura 1]. Los
resultados obtenidos se tabularon (Tabla 1) indi-
cando la posición máxima, la multiplicidad máxima
y el número de protones. El espectro confirma la
presencia de todos los grupos funcionales de
polímero y su completa formación.
La Figura 2 muestra los termogramas de CDB
de las nanopartículas de PBC y DPBC. Las na-
nopartículas de PBC mostraron una temperatura
de transición vítrea de 192,9 °C y un valor ∆H
de 1.230 mJ. Las nanopartículas de DPBC mos-
traron una temperatura de transición vítrea de
189,7°C y un valor ∆H de 1.546 mJ.
La Tabla 2 muestra el potencial zeta de las
nanopartículas de PBC y DPBC en cuatro me-
dios diferentes: 0,001 N HCl, solución salina al
0,9%, tampón de fosfato de pH 7,4 y tampón tris
de pH 8,0. Tanto el potencial zeta de las nano-
partículas de PBC como el de las nanopartículas
de DPBC aumentó al incrementar el pH, con un
resultado alto en el tampón tris de pH 8,0 y bajo
en 0,001 N HCl. Los resultados coincidieron con
16 para las nano-los obtenidos por Muller et al.
partículas de polialkil-cianoacrilatos como el
polimetil, polietil, polisobutil y polisohexil cia-
noacrilato. Esta tendencia se debe a que el incre-
mento de pH produce un aumento del grado de
disociación de los grupos de ácidos acrílicos li-
bres del polímero, que disminuye al reducir el
pH. Al mismo tiempo, no se puede descartar la
contribución del dextran en el incremento que se
aprecia en los valores de potencial zeta de las
nanopartículas debido a su disociación en medio
acuoso.
Ars Pharmaceutica, 45:3; 211-234, 2004ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES DE POLIMERIZACIÓN EN LA FORMACIÓN DE NANOPARTÍCULAS... 219
1FIGURA 1. Espectro H-NMR de polibutil-cianoacrilato.
1FIGURE 1. H-NMR spectrum of Poly(butyl cyanoacrylate).
1H-NMR de las nanopartículas de PBC.TABLA 1. Resultados del espectro
1H-NMR spectrum of PBC nanoparticles.TABLE 1. Results of
Nºde muestra Posición máxima (ppm) Multiplicidad Nº de protones
S.No. Peak position (ppm) Multiplicity No. of protons
1
0,96 Multiplete 3
2
1,42 Multiplete 2
3
1,74 Multiplete 2
4 2,53 Multiplete 2
5
4,28 Triplete deformado 2
6
7,26 Singlete 2
Ars Pharmaceutica, 45:3; 211-234, 2004HARIVARDHAN-REDDY L, MURTHY RSR.220
FIGURA 2. Termogramas de CDB de (a) nanopartículas de PBC y (b) nanopartículas de DPBC.
FIGURE 2. DSC thermograms of (a) PBC nanoparticles and (b) DPBC nanoparticles.
TABLA 2. Valores de potencial zeta de nanopartículas de PBC y DPBC.
TABLE 2. Zeta potential values of PBC and DPBC nanoparticles.
Medio de dispersión NP de PBC NP de DBPC
Dispersion medium PBC NPs DPBC NPs
0,001 N HCl -3,7 6,3
Solución salina 0,9%
-11,9 -4,3
0.9 % Saline
Tampón de fosfato pH 7,4
-30,4 -6,7
7.4 pH Phosphate buffer
Tampón tris pH 8,0 -42,8 -16,4
8.0 pH Tris buffer
PBC = polibutil-cianoacrilato, DPBC = politubtil-cianoacrilato cargado con doxorubicina, NP = nanopartículas.
PBC = Poly(butyl cyanoacrylate), DPBC = Doxorubicin loaded poly(butyl cyanoacrylate), NPs = nanoparticles.
La incorporación de DH a las nanopartículas Incorporation of DH into nanoparticles resul-
provocó una reducción del potencial zeta en to- ted in a reduction in zeta potential in all the
dos los medios. Las nanopartículas de DPBC media. DPBC nanoparticles exhibited positive zeta
mostraron un potencial zeta positivo en 0,001 N potential in 0.001N HCl, and a drastic reduction
HCl y una drástica reducción del potencial zeta in zeta potential in phosphate buffer pH 7.4 and
en el tampón de fosfato de pH 7,4 y el tampón tris buffer pH 8.0 in comparison to PBC nano-
tris de pH 8,0 en comparación con las nanopar- particles. This is probably due to drug adsorp-
tículas de PBC. Esto se debe probablemente a la tion on nanoparticle surface during polymeriza-
adsorción del fármaco en la superficie de la tion, leading to masking of polymeric charge.
nanopartícula durante la polimerización, que da Similar reduction in zeta potential of poloxamer
lugar a una ocultación de la carga polimérica. coated poly(DL-Lactide-co-glycolide) nanospheres
17 17Hawley et al. observaron una reducción similar was reported by Hawley et al.
del potencial zeta de las nanosferas de poli(DL- Zeta potential of nanoparticles becomes in-
láctido-co-glicólido) revestidas de poloxámero. creasingly important, when delivering drugs
El potencial zeta de las nanopartículas tiene through biological membranes. This is especia-
una gran importancia para la administración de lly true in case of lymphatic delivery, where the
fármacos a través de membranas biológicas. La interstitium of lymphatic system being negative-
relevancia de esta propiedad es especialmente ly charged, freely allows the anionic particles to
18significativa en el caso de la administración de penetrate aiding in high particle concentration
fármacos a través de los vasos linfáticos, en la at required site. In such cases, poly(butyl cya-
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