Formación de especies reactivas de oxígeno por interferencia en la expresión de la glutamatocisteína ligasa

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Colecciones : TFM. Máster en Neurociencias
Fecha de publicación : 2009
[ES]Este trabajo trata sobre la formación de especies reactivas de oxígeno por interferencia en la expresión de la glutamatocisteína ligasa.[EN]This paper deals with the formation of reactive oxygen species by interfering with the expression of glutamatocisteína ligase.
Publicado el : miércoles, 22 de agosto de 2012
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Fuente : Gredos de la universidad de salamenca
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Número de páginas: 21
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PROYECTO FIN DE MASTER MASTER OFICIAL EN NEUROCIENCIAS UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
   TRABAJO REALIZADO EN EL “DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR” DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA, BAJO LA DIRECCIÓN DE LOS DOCTORES JUAN PEDRO BOLAÑOS HERNÁNDEZ Y ÁNGELES ALMEIDA  PARRA.  
        
“FORMACIÓN DE ES   PECIES REACTIVAS DE OXÍGENO POR    INTERFERENCIA EN LA EXPRESIÓN DE    LA GLUTAMATO- CISTEÍN     A LIGASA”      
PATRICIA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ  9002
FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO POR INTERFERENCIA EN LA EXPRESIÓN DE LA GLUTAMATO- CISTEÍNA LIGASA
ÍNDICE   1. INTRODUCCIÓN ……………………………………………….   Página 2 - Mitocondria y estrés oxidativo……………………….   Página 2   - Glutatión (GSH): Función biológica y síntesis…....   Página 4      2. HIPÓTESIS Y OBJETIVO …………………………………...   Página 6      3. MATERIAL Y METODOS …………………………………… Página 7   - Especie ensayada, condiciones del animalario y   control de la edad gestacional………………………   Página 7   - Cultivo primario de neuronas………………………..   Página 7   - Transfecciones………………………………………….   Página 9   - Tratamiento con MitoSOX TM ………………………….   Página 10   - Transferencia de Western…………………………….   Página 10   - Citometría de flujo……………………………………...   Página 11   - Análisis estadístico de los resultados……………...   Página 12  
   4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..  Página 12   - Cultivo primario de neuronas corticales de rata….   Página 12   - Disminución de la expresión de la GCL mediante   SiRNA…………………………………………………….   Página 13   - Citometría de flujo……………………………………...   Página 15   - Microscopía……………………………………………...   Página 16       Página 17    
  5. CONCLUSIONES ………………………………………………   6. REFERENCIAS …………………………………………………    
 
 
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1. INTRODUCCIÓN   Las enfermedades neurodegenerativas son un grupo de patologías caracterizadas por la pérdida progresiva de neuronas en áreas concretas del cerebro. Entre ellas cabe destacar la Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica y Enfermedad de Huntington.   Las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson son las dos enfermedades neurodegenerativas mas prevalentes. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por una degeneración cognitiva progresiva. Se observan placas seniles compuestas de péptido beta amiloide y ovillos neurofibrilares constituidos principalmente por proteína tau hiperfosforilada. Existe una variante familiar que aparece a edades tempranas, aunque esto solo supone un 5-10% de los casos.(Brundin  et al.  2008) (Linazasoro 2008)   La Enfermedad de Parkinson se caracteriza por la pérdida de neuronas en la substantia nigra, y la aparición de inclusiones intraneuronales denominadas cuerpos de Lewy, que son inclusiones citoplasmáticas con alfa sinucleína y ubiquitina. A nivel clínico se caracteriza por una serie de defectos motores, como temblor, rigidez y bradicinesia, además de otra serie de síntomas no motores. Al igual que ocurre con la enfermedad de Alzheimer existen formas familiares en las que están implicadas al menos 10 loci genéticos distintos: PARK1-PARK10 (Olzmann  et al.  2004).   - MITOCONDRIA Y ESTRÉS OXIDATIVO   Cada vez existen mas evidencias que relacionan los defectos en la función mitocondrial y el estrés oxidativo con la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Se sabe que la mitocondria contribuye al envejecimiento mediante la acumulación de mutaciones en el DNA mitocondrial y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS).   La generación de especies reactivas de oxígeno a partir del oxigeno molecular es un proceso fisiológico que tiene lugar en las células de todos los organismos aeróbicos. Entre las principales especies reactivas de oxigeno se encuentran el anión superóxido (O 2 .- ) y el peróxido de hidrogeno (H 2 O 2 ) que se presentan en las células en concentraciones basales del orden de nanomolar y micromolar, respectivamente
 
 
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Cadena de transporte electrónico mitocondrialXantina Oxidasa
(Dawson y Dawson 1996). En general, y en el sistema nervioso central (SNC) en particular, el anión superóxido se forma  in vivo como consecuencia de la reducción incompleta del oxigeno en la cadena de transporte de electrones mitocondrial, aunque también puede generarse por la acción de enzimas como la xantina oxidasa. Su reacción con la enzima superóxido dismutasa (SOD) da lugar a la generación de H 2 O 2 , una sustancia poco reactiva pero con capacidad oxidante. El H 2 O 2  puede generarse además por la acción de otras enzimas como la monoamina oxidasa (catabolismo de la dopamina). El O 2-  puede reaccionar en presencia de hierro dando lugar a la formación de radicales hidroxilo ( . OH) mediante la reacción de Fenton. Asimismo, el H 2 O 2  y el O 2-  pueden reaccionar entre sí, en presencia de cationes metálicos, mediante la reacción de Haber-Weiss, generando igualmente radicales hidroxilo, que son especies altamente reactivas y oxidantes (Halliwell 1992; Peuchen et al. 1997). (Ver Esquema 1)                 Cuando se incrementa la producción de sustancias oxidantes, o bien se produce una deficiencia en los mecanismos antioxidantes intracelulares, las especies reactivas de oxigeno resultan dañinas para la célula. Esta situación de desequilibrio en la homeostasis redox intracelular, es decir, entre oxidantes y antioxidantes, es lo que se conoce como “estrés oxidativo”. Los daños celulares producidos por estas sustancias son de naturaleza variada y afectan a la estructura del DNA, de los lípidos de membrana y de muchas proteínas. En el sistema nervioso central, se ha descrito la implicación de las especies reactivas de oxigeno en los efectos tóxicos y
 
.-O2 Reacción de . NO Haber-Weiss .- O 2 + OH+ OH SOD ONOO - O2 - . Reacción de Fenton OH+ OHH 2 O 2 Fe 3+ Fe 2+ Monoamino Oxidasa Esquema 1: Generación de especies reactivas de oxígeno.
 
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neurodegenerativos que tienen lugar en patologías como la isquemia cerebral o las enfermedades de Parkinson y Alzheimer (Halliwell 1992; Moro et al. 2005).   - GLUTATIÓN (GSH): FUNCIÓN BIOLÓGICA Y SÍNTESIS.   El tripéptido glutatión ( γ -L glutamil-L-cisteinílglicina) se encuentra ampliamente distribuido en las células de animales, plantas y microorganismos. Es el compuesto tiólico presente en mayor concentración en todas las células (Meister 1988). Participa en distintas funciones como la detoxificación de xenobióticos, el mantenimiento de los grupos sulfhidrilo de las proteínas en su estado reducido, es cofactor de varias enzimas y constituye la forma de almacenamiento y transporte de la cisteína en la célula, pero su función más importante es la de anitoxidante intracelular, desempeñando un papel crucial en la defensa celular frente al estrés oxidativo y nitrosativo.   En su acción antioxidante, el glutatión puede combinarse de forma no enzimática con distintos radicales libres como superóxido, hidroxilo y óxido nítrico, o actuar como donador de electrones en la reducción de peróxidos, en una reacción catalizada por la glutatión peroxidasa. En ambos casos, el producto final es el glutatión oxidado o disulfuro de glutatión (GSSG) (Dringen 2000). El peróxido de hidrógeno, el oxido nítrico y el peroxinitrito reaccionan con el GSH mayoritariamente (>90%) mediante este mecanismo (Radi et al. 1991). El GSSG así formado es el sustrato de la flavoenzima glutatión reductasa que transfiere electrones del NADPH al GSSG, regenerando de esta forma el GSH. El estado redox celular viene determinado por la relación entre moléculas oxidadas y reducidas en la célula. En condiciones normales, el GSH representa el 98% del glutatión total intracelular. Al ser el glutatión el antioxidante mayoritario, incluso la oxidación de una pequeña cantidad de GSH a GSSG, puede producir importantes cambios en el estado redox celular.   Otros compuestos como los xenobióticos, se unen al glutatión por acción de las glutatión- S- transferasas formando aductos de glutatión que se excretan al espacio extracelular (Meister 1988). En el sistema nervioso central, este mecanismo de detoxificación está presente en astrocitos, pero no en neuronas (Johnson et al. 1993). El GSH y sus aductos se liberan al medio extracelular, donde son metabolizados a través de reacciones enzimáticas catalizadas por la γ -glutamíltranspeptidasa y la dipeptidasa, regenerándose de este modo la glicina y la cisteína. Este último es el aminoácido precursor limitante de la síntesis de GSH (Sagara et al. 1993). En
 
 
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situaciones de estrés oxidativo se produce además la eliminación al exterior celular de parte del GSSG formado (Meister 1988).   La concentración intracelular de GSH es un factor determinante de la vulnerabilidad neuronal al anión peroxinitrito (ONOO - ) (Radi et al. 1991; Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996) (Almeida et al. 1998; Clementi et al. 1998). De hecho, la concentración intracelular de GSH disminuye dramátciamente cuando las neuronas se exponen a ONOO -  endógeno o exógeno (Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996; Almeida et al. 1998; Almeida et al. 2001). Es más, el ONOO -  únicamente provoca el daño mitocondrial y la subsiguiente muerte celular en los astrocitos cuando en éstos se disminuyen drásticamente las concentraciones intracelulares de glutatión (Barker et al. 1996). En este sentido, es importante resaltar que los astrocitos disponen de una alta concentración intracelular de antioxidantes, como el glutatión (Raps et al. 1989) (Sagara et al. 1993; Bolanos et al. 1995) y vitamina E (Makar et al. 1994), que no poseen las neuronas, diferencia que puede explicar, al menos en parte, la resistencia de los astrocitos frente a la citotoxicidad del ONOO -.     Por otro lado, la activación del ciclo de las pentosas fosfato por H 2 O 2  (Ben- Yoseph et al. 1996) o peroxinitrito (Garcia-Nogales  et al.  2003) incrementa la disponibilidad de NADPH, necesario para la regeneración de GSH a partir de GSSG.   El glutatión se sintetiza de novo  en el citosol celular en dos reacciones ATP- dependientes consecutivas, catalizadas por la glutamato-cisteína ligasa (GCL, EC 6.3.2.2) y la glutatión sintetasa (GSHS, EC 6.3.2.3) (Ver esquema 2). La primera es limitante y se inhibe por retroalimentación por producto final (GSH) (Dringen 2000). En ésta, el L-glutamato y L-cisteína forman L- γ -glutamil-L-cisteína ( γ -GC). En la segunda reacción, la γ -GC se une a la L-glicina generando GSH.   La GCL es una proteína heterodimérica, compuesta por una subunidad catalítica (GCLCat, PM ~ 73000 Da) y una subunidad moduladora (GCLMod, PM ~30000 Da). Ésta modula la afinidad de la catalítica por los sustratos y los inhibidores, reduciendo así la K m  de la GCLCat por el glutamato, e incrementando la K i  para el GSH. Ambas subunidades han sido clonadas y secuenciadas (Yan yMeister 1990; Huang  et al.  1993), de forma que están codificadas por diferentes genes con diferentes localizaciones cromosomales. La expresión de ambas subunidades está poco coordinada, posiblemente por estar situadas en cromosomas diferentes, de forma que el control de la transcripción de ambas subunidades es independiente y diferente
 
 
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según los tejidos (Dahl yMulcahy 2001). Ambas subunidades están unidas mediante un puente disulfuro (Seelig  et al.  1984; Chang yChang 1994) (Misra yGriffith 1998) aunque a juzgar por la resistencia frente a tioles, es evidente la presencia de fuerzas no covalentes como decisivas en la estabilidad del dímero (Chang yChang 1994).     L-Glu GCLGSHS   γ -GCGSH     L-Cys ATPADP + PiATPADP + Pi   L-Gly     Esquema 2: Síntesis de glutatión (GSH)    2. HIPÓTESIS Y OBJETIVO   Dado que la GCL es la enzima limitante en la biosíntesis de novo  del GSH, su regulación es de especial importancia en la defensa celular frente al estrés oxidativo y/o nitrosativo. Por lo tanto, conocer las vías de señalización en las que está involucrado el glutation podría ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares implicados en la muerte neuronal que se asocia a las enfermedades neurodegenerativas.   Actualmente, la única herramienta conocida para estudiar la función del glutatión es el compuesto denominado L-butionina-sulfoximina (L-BSO), un análogo del L-glutamato que inhibe competitivamente la GCLcat. Sin embargo, L-BSO presenta el inconveniente de su inespecificidad, ya que también inhibe la glutation sintetasa, e imposibilidad de su uso in vivo , dado que no atraviesa la barrera hematoencefálica. Por este motivo, en el presente trabajo nos planteamos diseñar e implementar una herramienta molecular, a ser posible más específica, que nos permitiera interferir en la biosíntesis de glutation en cultivos primarios de neuronas. Con los resultados previsibles pretendemos establecer una herramienta útil para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la neurodegeneración asociada a ciertas enfermedades neurodegenerativas, tales como la Enfermedad de Parkinson.   
 
 
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3. MATERIAL Y MÉTODOS
  - ESPECIE ENSAYADA, CONDICIONES DEL ANIMALARIO Y CONTROL DE LA EDAD GESTACIONAL   Para la realización de todos los cultivos se emplearon ratas albinas de raza Wistar, criadas y suministradas por el Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Salamanca. Los animales se criaron en jaulas manteniendo un ritmo de luz-oscuridad de 12 horas, con fase de oscuridad entre las 20:00 y las 8:00 horas del día siguiente. La humedad osciló entre el 45 % y el 65 % y la temperatura entre los 20 ºC y los 25 ºC. Los animales se alimentaron ad libitum  con una dieta sólida estándar (17 % de proteínas, 3 % de lípidos, 58,7 % de glúcidos, 4,3 % de celulosa, 5 % de minerales y 12 % de humedad) y tuvieron en todo momento acceso libre al agua de bebida.     La edad gestacional de la rata se controló limitándose a una noche el tiempo de cohabitación de las ratas vírgenes con los machos. A las 9:00 horas de la mañana siguiente se separaron aquellas que presentaban espermatozoides en el frotis vaginal, acompañados de células epiteliales de la vagina características del día fértil del estro. Bajo estas condiciones, el periodo de gestación de la rata se asume que es de 21,7 días.    Todos los tratamientos con animales cumplen con la normativa vigente de la  comisión europea del 18.06.2007 (2007/526/CE) y la legislación española (RD 1201/2005) sobre las líneas directrices relativas al alojamiento y cuidado de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, y los protocolos fueron aprobados por el Comité ético para la Experimentación Animal y Humana del Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCyL).   - CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS   Para la realización del cultivo primario de neuronas se emplearon fetos de rata de 16 días de gestación (Almeida et al. 1998). Las ratas gestantes fueron anestesiadas con éter etílico y sacrificadas mediante dislocación cervical. Posteriormente se extrajeron los fetos mediante una histerectomía. Los fetos se
 
 
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trasladaron en una placa petri a una cabina de flujo laminar (TC48, Gelaire Flow Laboratories, McLean, Virginia, EEUU) para garantizar las condiciones de esterilidad del cultivo. Con la ayuda de tijeras, pinzas y papel impregnado en etanol al 70 %, se retiró el cráneo y se extrajeron ambos hemisferios cerebrales.   El tejido así obtenido se depositó sobre una placa Petri de poliestireno que contenía la solución de disgregación (NaCl 116 mM, KCl 5,4 mM, NaH2PO4 1,01 mM, MgSO4 1,5mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 4 mM, rojo fenol 10 mg/mL, albúmina 0,3 % p/v y DNAsa tipo I 20 µg/mL a pH 7,2) y, empleando un bisturí, se disgregó parcialmente y se dejó decantar en un tubo de 50 mL (BD, Falcon, Bedford, Massachussets, EEUU) durante 4 minutos. El sedimento obtenido se resuspendió en la solución de tripsinización (solución de disgregación suplementada con tripsina al 0,025 %, p/v) y se incubó a 37 ºC durante 15 minutos, en un baño agitando suavemente cada 2-3 minutos para facilitar la tripsinización. Transcurrido este tiempo, la digestión se detuvo añadiendo suero fetal de ternera (FCS; Roche Diagnostics, Heidelberg, Alemania) a una concentración final del 10 % v/v y el tejido se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos (Beckman Instruments, Palo Alto, California, EEUU).   El sedimento resultante se resuspendió en 12 mL de la solución de disgregación y, para conseguir su disociación, se hizo pasar 9 veces a través de una pipeta Pasteur previamente siliconada y con la punta redondeada. Tras dejar reposar la solución celular durante 4 minutos, se recogió cuidadosamente el sobrenadante conteniendo las células disociadas en un tubo de 50 mL. Este proceso se realizó otra vez resuspendiendo el sedimento en 9 mL de la solución de disgregación para incrementar la eficiencia. Los sobrenadantes obtenidos se combinaron y las células disociadas se centrifugaron de nuevo a 500 x g durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió primero en 1 mL de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Sigma-Aldrich Chemical Co., Barcelona, España) y, a continuación, en 20 mL de DMEM, y una pequeña alícuota de esta suspensión celular (10 µL) se diluyó cuatro veces y se mezcló con un volumen igual de azul de tripano (Sigma-Aldrich) al 0,4 % para el recuento celular, empleando para ello una cámara cuentaglóbulos de Neubauer (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y un microscopio de contraste de fases, modelo CK30 (Olympus, Japón).   Una vez determinado el número de células, la suspensión se diluyó en el medio de cultivo (DMEM suplementado con FCS al 10 %) y se sembraron a una densidad de de 250.000 células/cm2 en placas de cultivo (Nunc; Roskilde, Dinamarca) previamente
 
 
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recubiertas con poli-D-lisina (10 µg/mL; Sigma-Aldrich). Las placas se colocaron en un incubador termostatizado a 37 ºC (Thermo Forma 310, Thermo-Fisher Scientific, Ohio, EEUU) con una atmósfera saturada de vapor de agua, compuesta por un 95 % de aire y un 5 % de CO2.   A los dos días de cultivo, el medio se cambió por DMEM suplementado con suero de caballo (Sigma-Aldrich) al 5 % v/v, glucosa 20 mM (Sigma-Aldrich). Al cuarto día de cultivo se añadió arabinósido de citosina 1 0µM (Sigma-Aldrich) para impedir la proliferación de células no neuronales. Las célula sse utilizaron a los 6-7 días de cultivo. Bajo estas condiciones, los cultivos de neuronas mostraron una pureza aproximada del 97-99 %, determinada mediante inmunorreacción con el marcador neuronal Map-2 (Almeida  et al.  2005).   Todos los medios de cultivo se suplementaron con penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µg/mL) y anfotericina B (0,25 µg/mL) suministrados por Sigma- Aldrich.   - TRANSFECCIONES   Las transfecciones celulares se realizaron con el reactivo catiónico Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Madrid), siguiendo las instrucciones detalladas por el fabricante. Para reducir la expresión de GCL decidimos emplear la tecnología del RNA de interferencia. Basándonos en criterios de diseñ oracional de siRNA (Reynolds  et al.   2004), seleccionamos la secuencia mostrada en la Tabla 1, que está dirigida contra la subunidad catalítica de la GCL. Como control empleamos un siRNA dirigido contra la luciferasa, por emplearse de forma rutinaria en nuestro laboratorio (Tabla 1). La concentración final de siRNA empleada fue de 100 nM. Los dúplex siRNAs se adquirieron comercialmente (Dharmacon, Lafayette, Colorado, EEUU).    SiRNA GCL 5´-GAAGGAGGCTACTTCTATA-3´   SiRNA Luciferasa 5´-CTGACGCGGAATACTTCGA-3´ 
cToabmloa  1c:o nStercoul e(SnicRiaNsA  dLelu cSiifRerNaAs ae).m  p  l e    a    d    o       p    a    r   a    dis   minuir la    expresi   ón de la    GCL y     Por otro lado, estas mismas secuencias se utilizaron también en forma de RNA en horquilla de pequeño tamaño o small hairpin RNA( shRNA) mediante el empleo del
 
 
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vector de expresión pSuper-neo/GFP (Oligoengine, Seattle, Washington, EEUU). La elección de este sistema nos permitió identificar las células eficientemente transfectadas por selección del marcador (GFP) mediante citometría de flujo.   Como es sabido,   la estructura en horquilla del shRNA se reconoce por la enzima Dicer, que la digiere en los RNA pequeños de interferencia (siRNA) funcionales. Así, tanto por el método del siRNA como del shRNA, la separación de las hebras del siRNA permite la unión de una de ellas a la secuencia complementaria del RNA mensajero. Como consecuencia se produce la degradación del mRNA por el complejo RISC, que conduce a una disminución de la abundancia de la proteína.   - TRATAMIENTO CON MITOSOX   MitoSOX TM  Red es un reactivo derivado de hidroxietidina (HE) que permite detectar de manera selectiva la producción de anión superóxido en células vivas mediante citometría de flujo y microscopia confocal. La oxidación del anión superóxido produce la liberación de un producto fluorescente que se excita a una longitud de onda de 480 nm, con un máximo de emisión de 567 nm. MitoSOX TM  Red se dirige específicamente hacia la mitocondria, donde se une al DNA mitocondrial y muestra fluorescencia en función del grado de oxidación.   Para el tratamiento con MitoSOX TM  Red se lavaron las células una vez con el medio Hanks (glucosa 5.5 mM, Ca 2+ , Mg 2+ , pH=7.4) a 37 ºC. Posteriormente se realizó una incubación con MitoSOX TM  Red durante 30 minutos en un incubador termostatizado a 37ºC. Luego se realizaron lavados nuevamente con Hanks y se tripsinizó con EDTA al 10%. Las muestras así obtenidas se pusieron en tubos de citómetro, centrifugando durante 5 minutos a 500g. El sobrenadante obtenido en la centrifugación se desechó y se realizo un nuevo lavado con 500  L de Hanks, volviendo a centrifugar 5 minutos a 500g. Finalmente, el pellet obtenido se resuspendió en un volumen final de 500  L de Hanks frío y se analizó por citometría de flujo.   - TRANSFERENCIA DE WESTERN   Para obtener los extractos proteicos totales, las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis, compuesto por RIPA (SDS al 1 %, EDTA 0,5 M, Triton Tx-100 al 1 % v/v, NaCl 150 mM, Na 2 HPO 4  10 mM a pH 7,0) al que se le añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas (aprotinina 50 µg/mL, leupeptina 50 µg/mL,
 
 
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