Acetiltransferasas de histonas en Candida albicans: análisis del perfil transcripcional

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Publicado por

Colecciones : TD. Ciencias biosanitariasDMG. Tesis del Departamento de Microbiología y Genética
Fecha de publicación : 2011
[ES] Candida albicans es un hongo oportunista capaz de crecer adoptando diferentes morfologías según las condiciones del medio por lo que además resulta útil como modelo en estudios de diferenciación molecular.[EN] Candida albicans is an opportunistic fungus capable of growing adopting different morphologies depending on environmental conditions as well as a model useful in studies of molecular differentiation.
Publicado el : viernes, 24 de agosto de 2012
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Fuente : Gredos de la universidad de salamenca
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Número de páginas: 256
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Departamento de Microbiología y Genética

Instituto de Biología Funcional y Genómica





ACETILTRANSFERASAS DE HISTONAS EN
Candida albicans:
ANÁLISIS DEL PERFIL TRANSCRIPCIONAL






Memoria presentada por Dª. Rosa María Dégano Blázquez para optar al
grado de Doctor en Biología

2011



Dr. Ángel Domínguez Olavarri Catedrático de Microbiología de la Universidad
de Salamanca



CERTIFICA:



Que la Tesis Doctoral titulada: “Acetiltransferasas de histonas en Candida
albicans: Análisis del perfil transcripcional” presentada por la Lda: Rosa María Dégano
Blázquez, ha sido realizada bajo su dirección en el Departamento de Microbiología y
Genética de la Universidad de Salamanca.

Y para autorizar su presentación y evaluación por el tribunal correspondiente
firma este certificado en Salamanca a de de 2011.






Fdo: Dr. Ángel Domínguez Olavarri



Dr. Ángel Domínguez Olavarri, Director del Departamento de Microbiología y
Genética de la Universidad de Salamanca



CERTIFICA:



Que la memoria titulada: “Acetiltransferasas de histonas en Candida albicans.
Análisis del perfil transcripcional” presentada por la Lda. Rosa María Dégano Blázquez,
para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizada bajo la dirección del Dr.
Ángel Domínguez Olavarri en el Departamento de Microbiología y Genética de la
Universidad de Salamanca.

Y para que así conste, expide y firma la presente certificación en Salamanca,
a de de 2011.






Fdo: Dr. Ángel Domínguez Olavarri



























Este trabajo ha sido parcialmente financiado por los proyectos:

Glycoshield: surface modulation of the fungal and host response using a genomic
approach. Redes del Espacio Europeo de Investigación (esquema ERA-NET).
GEN2006-27775-C2-E/PAT.

“Histona acetiltransferasas en Candida albicans efecto sobre dimorfismo y virulencia.
Una aproximación Post-genómica” (SA 141ª08). Junta de Castilla y León.



Índice

I. INTRODUCCIÓN
1. ASPECTOS GENERALES DE LA BIOLOGÍA DE Candida albicans. POSICIÓN
TAXONÓMICA……………………………………………………………...…………………………1
2. IMPORTANCIA DEL GÉNERO CANDIDA COMO AGENTE PATÓGENO……………………..4
2.1. Tratamiento de las candidiasis……………………………………………………………..6
2.2. Factores de virulencia de Candida albicans……………………………………………….8
2.3. Transición dimórfica en Candida albicans………………………………………...……..12
2.4. Dimorfismo en Candida albicans………………………………………………...………14
3. RUTAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES…………………………………………………....17
3.1. Ruta de proteínas quinasas activada por mitógeno (ruta MAPK)………………..……….17
3.2. Ruta de la proteína quinasa A dependiente de cAMP (ruta PKA-cAMP)……….…….…19
3.3. Otras rutas inductoras de la filamentación………………………………………………..24
3.4. Regulación negativa de la filamentación…………………………………………………25
4. EL OVILLO DINÁMICO DE LA VIDA: LA CROMATINA……………………………………..27
4.1. Composición estructural de la cromatina………………………………………………....28
4.2. Mecanismos de regulación transcripcional. Características generales…………………...30
4.3. Papel de los procesos de acetilación-desacetilación de histonas en la regulación
transcripcional…………………………………………………………………………............32
4.4. El “código histona”…………………………………………………………………….…34
4.5. Complejos acetiltransferasa de histonas (complejos HATs)…………………………..…34
4.6. Complejos acetiltransferasa de histonas multifuncionales…………………………….....38
4.7. Acetiltransferasa de histona 1 de Saccharomyces cerevisiae, ScHat1p………………….39
4.8. Acetiltransferasa de histona 5 de Saccharomyces cerevisiae, ScGcn5p…………...……..42
4.9. Acetiltransferasas de histonas en Candida albicans……………………………...………45
5. ANÁLISIS DE LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE
MICROARRAYS…………………………………………………………………………….......45
II. OBJETIVOS
1. OBJETIVOS DE ESTE TRABAJO......…………………………………………………………….49
III. MATERIALES Y MÉTODOS
1. MICROORGANISMOS UTILIZADOS…………………………………………………………....51
1.1. Cepas de Candida albicans…………………………………………………………….....51
1.2. Cepas de Escherichia coli………………………………………………………………...52

I
Índice

2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO…………………………………...………………….52
2.1. Medios y condiciones de cultivo de Escherichia coli…………………………………….52
- Medio LB
2.2. Medios y condiciones de cultivo de Candida albicans………………………………......52
2.2.1. Crecimiento levaduriforme…………………………………………………….53
- YNB
- YEPD
- Medio Lee
- Medio Mínimo (también llamado medio SD) con sorbitol 1M
- Medio Mínimo suplementado con 5-FOA y uridina
2.2.2. Inducción del crecimiento filamentoso en medio sólido………………………54
- Medio embebido
- Medio SLAD
- Medio Spider
- Medio Lee + 4% suero
- Medio Lee + N-Acetil-glucosamina
2.2.3. Inducción del crecimiento filamentoso en medio líquido……………………...56
- Inducción por cambio de temperatura
- Inducción por cambio de temperatura y presencia de suero
- Inducción por cambio de pH
- Inducción por N-acetilglucosamina (NAcGlc) y cambio de pH
2.2.4. Inducción de la formación de clamidosporas…………………………………..57
2.3. Mantenimiento de los microorganismos………………………………………………….58
3. PLÁSMIDOS UTILIZADOS……………………………………………………………………….58
3.1. Plásmidos bacterianos…………………………………………………………………….58
- pBluescript KS+ y SK+
- pGEM-T
3.2. Plásmidos utilizados en Candida albicans...…………………………..…………………59
- Plásmido pSNC1
- Plásmido integrativo pYPB-ADH
- Plásmido pAG1
4. DELECIÓN DE GENES EN Candida albicans…………………………………..………………...61
5. TRANSFORMACIÓN DE MICROORGANISMOS………………………………………………62
II
Índice

5.1. Transformación de Escherichia coli………………………………………….…………..62
5.2. Transformación de Candida albicans………………………………………………….....63
5.2.1. Inducción de la pérdida del marcador URA3 y selección con 5-FOA………....64
6. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS………………………………….65
6.1. Aislamiento de DNA plasmídico de Escherichia coli……………………………………65
6.2. Aislamiento de DNA genómico de levaduras…………………………………………….66
6.3. Obtención de RNA total de levadura…………………………………………………......67
6.4. Determinación de la concentración de ácidos nucleicos………………………………….67
6.5. Digestión del DNA con endonucleasas de restricción……………………………………68
6.6. Electroforesis de DNA en geles de agarosa………………………………………………68
6.7. Purificación de fragmentos de DNA……………………………………………………...69
6.8. Construcción de plásmidos recombinantes……….………………………………………69
6.9. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)……………………………………………..69
6.9.1. Diseño de Oligonucleótidos……………………………………………………69
6.9.2. Condiciones de la reacción de PCR……………………………………………70
6.10. Hibridación de ácidos nucleicos………………………………………………………...71
6.10.1. Preparación de sondas marcadas radiactivamente…………………………....71
6.10.2. Detección de secuencias de DNA específicas: hibridación DNA-DNA o
SOUTHERN BLOT…...…………………………………………………..…………..72
6.10.3. Detección de RNA mensajero: hibridación DNA-RNA o NORTHERN
BLOT……...……………………………………………………………………….….73
7. MICROSCOPÍA………………………………………………………………………...…………..75
7.1. Estereomicroscopía………………………………………………………………75
7.2. Microscopia óptica………………………………………………….…75
7.3. Tinciones…………………………………………………………………...…….75
- Tinción de pared y septos celulares con calcofluor white
- Tinción con DAPI y calcofluor white
- Tinción con lactofenol-azul algodón (tinción de clamidosporas)
- Tinción con azul de metileno
8. MICROARRAYS DE cDNA: COMPARACIÓN DE PERFILES TRANSCRIPCIONALES…..…77
8.1. Características de los microarrays de Candida albicans………..………………...……...78
8.2. Diseño experimental llevado a cabo con microarrays de Candida albicans……..………80
8.3. Aislamiento de RNA total………………………………………………………………...81
8.4. Obtención de cDNA marcado con fluorocromos…………………………………………82
III
Índice

8.5. Purificación, cuantificación y concentración de cDNA…………………….…………….83
8.6. Hibridación y lavado de microarrays……………………………………………………..84
8.7. Análisis de los datos obtenidos…………………………………………………………...85
8.7.1. Identificación de los genes expresados diferencialmente………………….......85
8.7.2. Comparación de datos de expresión diferencial en condiciones múltiples…….87
8.7.3. Análisis de las categorías funcionales asociadas a expresión diferencial……...87
9. PROGRAMAS DE OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO INFORMÁTICO DE DATOS…………..88
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. INTERRUPCIÓN DE LOS GENES CaGCN5, CaHAT1 Y CaHAT2 DE C. albicans……………..91
1.1. Genes con función acetiltransferasa de histonas de la base de datos CandidaDB…………..91
2. LA SECUENCIA NUCLEOTÍDICA DEL GEN GCN5 DE Candida albicans……………………93
2.1. Análisis de la región 5´ no codificante………………………………………….………..93
2.2. Análisis de la región 3´ no codificante del gen GCN5……………………………………96
2.3. Estudio de la región codificante del gen GCN5…………………………………….…….96
2.4. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína Gcn5p…………………………..97
3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN GCN5 DE Candida albicans……………………….100
4. CONSTRUCCIÓN DEL CASSETTE DE INTERRUPCIÓN DEL GEN GCN5…………….……101
5. OBTENCION DEL MUTANTE HOMOCIGÓTICO EN EL GEN GCN5……………………….102
6. COMPLEMENTACION DE LA DELECIÓN DEL GEN GCN5………………………………...104
7. LOCALIZACION DE LA PROTEÍNA Gcn5p FUSIONADA A LA PROTEÍNA GFP…………107
8. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LOS MUTANTES OBTENIDOS…………………………….…..110
8.1. Efecto de la deleción de GCN5 en el crecimiento y la morfología celular a 28ºC……...110
8.2. Efecto de la deleción GCN5 en filamentación…………………………………………..112
8.2.1. Análisis de la capacidad de filamentación en medio sólido……..…………...112
8.2.2. Análisis de la capacidad de filamentación en medio líquido…………………114
8.2.3. Efecto de la deleción de GCN5 en la formación de clamidosporas…………..117
9. PERFIL TRANSCRIPCIONAL DE LACEPA RDG4-6 (gcn5/gcn5)……………………….……120
9.1. Efecto de la deleción del gen GCN5 en la regulación de la expresión génica………….120
9.2. Análisis del perfil transcripcional de la cepa RDG4-6 (gcn5/gcn5) durante el crecimiento
exponencial a 28ºC. Distribución de los genes expresados diferencialmente en categorías
funcionales…………………………………………………………………………………...122
9.3. Análisis del perfil transcripcional de la cepa RDG4-6 (gcn5/gcn5) durante la transición
dimórfica a 37ºC………………………………………………...…………………………...133

IV
Índice

10. LA SECUENCIA NUCLEOTÍDICA DEL GEN HAT1 DE Candida albicans………………….143
10.1. Análisis de la región 5´ no codificante del gen HAT1…………………………………145
10.2. Análisis de la región 3´ no codificante del gen HAT146
10.3. Estudio de la región codificante del gen HAT1………………………………………..146
10.4. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína Hat1p……………..………….147
11. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL GEN HAT1 DE Candida albicans……………………...149
12. CONSTRUCCIÓN DEL CASSETTE DE INTERRUPCIÓN DEL GEN HAT1………….……..150
13. OBTENCION DEL MUTANTE HOMOCIGÓTICO EN EL GEN HAT1…………………..…..151
14. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LOS MUTANTES OBTENIDOS………….……………………153
14.1. Efecto de la deleción del gen HAT1 en el crecimiento y la morfología celular a
28ºC…………………………………………………………..………...53
14.2. Efecto de la deleción del gen HAT1 en filamentación………………………..………..157
14.2.1. Análisis de la capacidad de filamentación en medio sólido………………...157
14.2.2. Análisis de la capacidad de filamentación en medio líquido………………..159
14.2.3. Efecto de la deleción del gen HAT1 en la formación de clamidosporas……162
15. PERFIL TRANSCRIPCIONAL DE LACEPA RGL4-4 (hat1/hat1)……………………………162
15.1. Efecto de la deleción del gen HAT1 en la regulación de la expresión génica…………163
15.2. Análisis del perfil transcripcional de la cepa RGL4-4 (hat1/hat1) durante el crecimiento
exponencial a 28ºC. Distribución de los genes expresados diferencialmente en categorías
funcionales…………………………………………………………………………….……..164
15.3. Análisis del perfil transcripcional de la cepa RGL4-4 (hat1/hat1) durante la transición
dimórfica a 37ºC………………………………………………………………………….….169
16. LA SECUENCIA NUCLEOTÍDICA DEL GEN HAT2 DE Candida albicans………………….175
16.1. Análisis de la región 5´ no codificante del gen HAT2…………………………………177
16.2. Análisis de la región 3´ no codificante del gen HAT2………………………………....178
16.3. Estudio de la región codificante del gen HAT2…………………………………….….178
16.4. Análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína Hat2p……………………...…179
17. CONSTRUCCIÓN DEL CASSETTE DE INTERRUPCIÓN DEL GEN HAT2………………...181
18. OBTENCION DEL MUTANTE HOMOCIGÓTICO EN EL GEN HAT2…………………...….183
19. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LOS MUTANTES OBTENIDOS………………………...……..185
19.1. Efecto de la deleción del gen HAT2 en el crecimiento y la morfología celular a
28ºC…………………………………………………………………………………...……..185
19.2. Efecto de la deleción del gen HAT2 en filamentación………………………………....186
19.2.1. Análisis de la capacidad de filamentación en medio sólido…….……….….186
V

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domingo, 09 de junio de 2013 - 2:01