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TÉCNICAS DE ESTUDIO DE FAGOCITOSIS IN VIVO Y SU APLICACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN... 43
PROCEDURES TO STUDY THE IN VIVO PHAGOCYTOSIS AND APPLICATION FOR THE INVESTIGATIÓN OF IMMUNOMODULATORY...
Técnicas de estudio de fagocitosis in vivo y su
aplicación en la investigación de la actividad
inmunomuduladora de antibióticos
Procedures to study the in vivo phagocytosis and application for the
investigation of immunomodulatory activity of antibiotics
1 2 2 2*ALKOUWATLI K , LEIVA M , RUIZ-BRAVO A , JIMÉNEZ-VALERA M
1 Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Damascus, Syria.
2Department of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Granada, Spain.
*Author for correspondence. E-mail: mjvalera@ugr.es
RESUMEN
La depuración de partículas de la sangre es una medida de la capacidad funcional del sistema fagocítico
mononuclear, responsable de la eliminación sistémica de microorganismo patógenos, inmunocomplejos
y células apoptósicas. Esta capacidad puede ser alterada por agentes modificadores de la respuesta
biológica, entre los que figuran numerosos agentes antimicrobianos. En este trabajo se comparó la
efectividad de la medida de la capacidad de depuración de ratones BALB/c inoculados con distintos
microorganismos (una levadura, dos bacterias Gram-positivas, extra- e intracelular, y dos bacterias
Gram-negativas, asimismo extra- e intracelular). La levadura Candida albicans fue seleccionada, por su
apropiada cinética de depuración y su resistencia natural a agentes antibacterianos, para estudiar la
modificación de la fagocitosis in vivo por el antibiótico macrólido azitromicina. El tratamiento con
azitromicina durante 10 y 20 días disminuyó la capacidad de depuración del sistema fagocítico-mononuclear.
PALABRAS CLAVE: Fagocitosis. Depuración. Modelo murino. Microorganismos extracelulares. Microorganismos intracelulares.
Azitromicina. Tratamiento de larga duración.
ABSTRACT
The blood stream clearance of particles is a measure of the functional capacity of the mononuclear
phagocytic system, which is responsible for the systemic elimination of pathogenic microorganisms,
immunocomplexes and apoptotic cells. This capacity may be altered by biological reponse modifiersresponse,
in which numerous antimicrobial agents are present. In this work, the effectiveness of the measurement
of clearance capacity was compared in BALB/c mice that were inoculated with different microorganisms
(a yeast, two extra and intracellular gram-positive bacteria, and two extra and intracellular gram-negative
bacteria). As a means to studying the in vivo modification of phagocytosis by the macrolid antibiotic,
azithromycin, the yeast Candida albicans was chosen for its appropriate clearance kinetics and its natural
resistance to antibacterial agents. Treatment with azithromycin for 10 and 20 days reduced clearance
capacity of the mononuclear phagocytic system.
KEYWORDS: Phagocytosis. Clearance. Mouse model. Extracellular microorganisms. Intracellular microorganisms. Azithromycin.
Long-term therapy.
1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION
La fagocitosis es un mecanismo crucial en Phagocytosis is a crucial mechanism in innate
1 1la inmunidad innata . Las células fagocíticas immunity . Phagocytic cells are chemotacti-
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55ALKOUWALTLI K, LEIVA M, RUIZ-BRAVO A, JIMÉNEZ-VALERA M44
son atraídas quimiotácticamente hacia los fo- cally attracted towards inflammatory sources
cos inflamatorios inducidos por la presencia induced by the presence of pathogenic agents
de agentes patógenos en los tejidos. Alterna- in tissues. Alternatively, the mononuclear
tivamente, el sistema fagocítico mononuclear phagocytic system consists of a number of
consiste en un número de fagocitos fijos en fixed phagocytes in certain organs, such as
ciertos órganos, como bazo e hígado, que the spleen and liver, which remove foreign
2retiran las partículas extrañas presentes en la particles from blood . This blood clearance
2sangre . Esta actividad de depuración de la activity represents an important parameter in
sangre es un parámetro importante de la ca- the defence capacity of the organism against
pacidad de defensa del organismo frente a microorganisms, immunocomplexes and cell
microorganismos, inmunocomplejos y células death due to apoptosis. Accordingly, a defi-
muertas por apoptosis. Por tanto, una defi- ciency in clearance capacity may bring about
ciencia en la capacidad de depuración tiene a greater risk of susceptibility to infection and
3,4como consecuencia un mayor riesgo de infec- immunopathological disorders . Several tech-
3,4ciones y de trastornos inmunopatológicos . niques in the experimental study of blood
Se han propuesto diversas técnicas para el clearance by phagocytes have been proposed.
estudio experimental de la depuración de la Some of these have been based on the reten-
sangre por fagocitos. Algunas se basan en la tion of inert particles, such as colloidal car-
retención de partículas inertes, como carbón bon, by tissue phagocytes. Others use live
coloidal, por los fagocitos tisulares. Otras uti- microorganisms, which are inoculated intra-
lizan microorganismos vivos, que se inoculan venously, in order to quantify blood stream
por vía intravenosa para cuantificar la tasa de clearance rates in terms of time. The so ca-
depuración del torrente circulatorio en fun- lled «modifying agents» of biological respon-
ción del tiempo. Los llamados agentes modi- se, («Biological Response Modifiers»(BRMs)
ficadores de la respuesta biológica o BRMs are defined by the modulating effects on the
5(de «Biological Response Modifiers») se defi- immune system . One of the most common
nen por los efectos moduladores que ejercen action mechanisms of BRMs is the effects that
5en el sistema inmune . Uno de los mecanis- these have on phagocyte cells. BRMs can
mos más comunes de acción de los BRMs es modify phagocyte capacity, the effectiveness
a través de sus efectos sobre las células fago- of intracellular microbicidal mechanisms and
cíticas. Los BRMs pueden modificar la capa- the secretion of mechanisms cytokines by
cidad de fagocitosis, la eficiencia de los me- phagocytes. These have direct effects on in-
canismos microbicidas intracelulares y la fection resistance, and indirect effects due to
secreción de citokinas por fagocitos. Esto tie- the immunoregulatory effect of the cytokines,
ne consecuencias directas sobre la resistencia which modulate both antibody response and
5a la infección, e indirectas por la acción in- cellular immunity . It is currently well known
munorreguladora de las citokinas que modu- that numerous antimicrobial agents present BRM
6 7lan tanto la respuesta de anticuerpos como la activity . Many of these affect the phagocytes .
5inmunidad celular .Actualmente es bien cono- The macrolide antibiotics possess interesting
cido que numerosos agentes antimicrobianos immunomodulating properties, which are pos-
6poseen actividad BRM . Muchos de ellos ejer- sibly related to an intracellular accumulation
7cen efectos sobre fagocitos . Los antibióticos at concentrations that are several times higher
macrólidos poseen interesantes propiedades than extracellular concentrations, especially in
8inmunomoduladoras, posiblemente relaciona- phagocytes . Treatment with macrolides is
das con su acumulación intracelular a con- beneficial for patients with chronic pulmona-
centraciones varias veces superiores a las ry inflammation, such as cystic fibrosis, diffu-
8extracelulares, especialmente en fagocitos . El se panbronchiolitis, bronchiectasis and asth-
9,10tratamiento con macrólidos es beneficioso para ma . The anti-inflammatory properties of
enfermos con patología de inflamación pul- macrolides are attributed to the interference
monar crónica, como fibrosis quística, pan- with the production of proinflammatory cyto-
9,10 8,10bronquiolitis difusa, bronquiectasia y asma . kin production by phagocytes .The objecti-
Las propiedades anti-inflamatorias de los ve of the present work is to comparatively
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55.TÉCNICAS DE ESTUDIO DE FAGOCITOSIS IN VIVO Y SU APLICACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN... 45
PROCEDURES TO STUDY THE IN VIVO PHAGOCYTOSIS AND APPLICATION FOR THE INVESTIGATIÓN OF IMMUNOMODULATORY...
macrólidos se atribuyen a interferencia con la determine kinetic clearance of different extra
producción de citokinas pro-inflamatorias por and intracellular microorganisms, and to apply
8,10fagocitos . El objetivo del presente trabajo this methodology to the study of the influen-
es determinar comparativamente la cinética de ce of the macrolides azithromycin over pro-
depuración de distintos microorganismos, ex- longed periods of time on in vivo phagocyte
tra- e intracelulares, y aplicar esta metodolo- activity.
gía al estudio de la influencia de la adminis-
tración durante periodos prolongados del
macrólido azitromicina sobre la actividad fa- 2. MATERIAL AND METHODS
gocítica in vivo.
Animals
2. MATERIALES Y MÉTODOS Female BALB/c mice of 5 to 6 weeks of
age and about 20g in body weight were used.
Animales These were obtained from the Animal Expe-
rimentation Unit of the University Instrumen-
Se utilizaron ratones BALB/c, hembras, de tation Centre of Granada. The animals were
5 a 6 semanas de edad y de alrededor de 20 maintained free of pathogens, with ad libitum
g de peso corporal, procedentes de la Unidad access to water and sterile Standard chow.
de Animales de Experimentación, perteneciente
al Centro de Instrumentación de la Universi-
Microorganismsdad de Granada. Los animales se mantuvie-
ron, libres de patógenos, con acceso ad libi-
tum a agua y pienso estándar estériles. Strains of the species Escherichia coli, Sal-
monella enterica serovar Typhimurium, Micro-
coccus luteus, Listeria monocytogenes and Can-
Microorganismos dida albicans were obtained from the
microbiology department’s culture collection.
Se usaron cepas de la colección de culti- These were subsequently cultivated in tryptic
vos del Departamento de Microbiología, per- soy agar (TSA;Difco) in tubes in slanted po-
tenecientes a las especies Escherichia coli, sition. After 24 hrs of incubation at 37ºC, sterile
Salmonella enterica serovar Typhimurium, isotonic phosphate buffered saline suspensio-
Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes ns (PBS) at ph 7.2 were prepared. Microbial
y Candida albicans. Las cepas se cultivaron concentration was adjusted to approximately
7en Agar tripticasa soja (TSA; Difco) inclinado 10 microorganisms per ml by turbidimetry.
en tubos. Tras 24 de incubación a 37ºC, se
prepararon suspensiones en tampón fosfato
salino isotónico, a pH 7.2 (PBS), estéril. La Clearance testing
concentración microbiana se ajustó por turbi-
7dez a aproximadamente 10 microorganismos The animals were given light ether anaes-
por ml. thesia, in order to carry out intravenous mi-
crobial suspension inoculation more easily. Each
mouse was given a single injection of 100µl
Ensayo de depuración in the retro orbital venous plexus of the left
eye and time was measured with a stop wat-
Los animales fueron sometidos a una lige- ch. At 1, 5 & 10 min from inoculation, ether
ra anestesia etérea, para proceder con como- anaesthesia was repeated, in order to carry
didad a la inoculación de la suspensión mi- out blood extractions of a volume of approxi-
crobiana, por vía intravenosa. Cada ratón recibió mately 150µl, using a sterile Pasteur pipette.
una única inyección de 100 µl en el plexo So as to avoid coagulation, the blood obtai-
venoso retrorbital del ojo izquierdo, registran- ned was transferred to tubes containing 10 µl
do el tiempo en un cronómetro. Transcurridos of heparin. From each blood sample two se-
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-1 -21, 5 y 10 min de la inoculación, se repitió la rialized dilutions (10 & 10 ) in sterile PBS
anestesia etérea para realizar extracciones de were carried out 100 µl of original sample
volúmenes de sangre de alrededor de 150 µl, each dilution and cach were then deposited
mediante pipeta pasteur estéril. La sangre se over the surface of the TSA dishes and spread
llevó a tubos con 10 µl de heparina, con el using a glass spatula. The dishes were incu-
objeto de evitar la coagulación. De cada muestra bated for 24 hrs at 37ºC, after which a count
de sangre se realizaron dos diluciones seria- of the number of colonies was carried out.
-1 -2das (10 y 10 ) en PBS estéril, y 100 µl de Counts of between 30 and 300 colonies per
la muestra original y de cada dilución se de- dish were considered as valid. The results
positaron en la superficie de placas de TSA y were expressed in terms of colony forming
se extendieron por ella mediante una espátula units (CFU) per ml of blood.
de vidrio. Las placas se incubaron 24 h a 37ºC,
tras lo cual se procedió al recuento de colo-
nias. Se dieron como válidos los recuentos Azithromycin treatment
comprendidos entre 30 y 300 colonias por
placa. Los resultados se expresaron como The macrolide antibiotic, azithromycin, was
Runidades formadoras de colonias (CFU) por obtained commercially (Zitromax 500 mg,
ml de sangre. Pfizer), in powdered form for use in the pre-
paration of perfusion solution. Each animal
received a dose of 7.1mg per kg per day (ex-
Tratamiento con azitromicina trapolated from doses used in human thera-
py), through intraperitoneal injection. The effect
El macrólido azitromicina se obtuvo co- of the treatment after 10 and 20 days was
Rmercialmente (Zitromax 500 mg de Pfizer), examined. In each case, the animals were
en forma de polvo destinado a la preparación sacrificed on the last day of treatment toge-
de disoluciones para perfusión. Cada animal ther with a similar batch that were treated for
recibió una dosis de 7.1 mg por Kg y día the same period of time with the same volu-
(extrapolada de las dosificaciones usadas en me of aqueous vehicle.
terapia humana), por vía intraperitoneal. Se
examinó el efecto de tratamientos de 10 y 20
días de duración. En cada caso, el último día Statistical analysis of the results
del tratamiento, los animales fueron sacrifica-
dos, junto con un lote similar tratado durante The statistical significance of the results
el mismo tiempo con el mismo volumen del obtained from the differences between treated
vehículo acuoso. and untreated control animals was determined
using the Student t test. Experimental batches
consisted of 4 animals. The values of P < 0.05
Análisis estadístico de los resultados were considered as significant.
La significación estadística de las diferen-
cias entre animales tratados y controles no 3. RESULTS
tratados se determinó mediante la prueba de
la t de Student. Los lotes experimentales cons- The first part of this study was focussed on
taron de 4 animales. Los valores de P < 0.05 the comparison of varying test microorganis-
se consideraron significativos. ms for the in vivo phagocytosis tests, in whi-
ch clearance of previously intravenously ad-
ministered particles was measured in terms of
3. RESULTADOS time. This comparison was carried out using a
yeast, Candida albicans, and four bacteria
La primera parte de este estudio se centró species. Two of these were Gram-negative,
en la comparación de diversos microorganis- one an extracellular type (Escherichia coli) and
mos de prueba para el ensayo de fagocitosis the other intracellular (Salmonella enterica
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in vivo, en el que se mide la depuración, en serovar Typhimurium). Similarly, an extrace-
función del tiempo, de partículas previamente llular and intracellular Gram-positive bacteria
administradas por vía intravenosa. En esta com- were used, these being Micrococcus luteus and
paración se incluyeron una levadura, Candida Listeria monocytogenes respectively.
albicans, y cuatro bacterias, dos Gram-nega- Figure 1 shows the results of the tests ca-
tivas, de las cuales una extracelular (Escheri- rried out with C. albicans. Clearance rates (with
chia coli) y otra intracelular (Salmonella ente- initial CFU counts carried out at one minute
rica serovar Typhimurium), y dos Gram- after inoculation taken as reference) were found
positivas, una extracelular (Micrococcus lu- to be 65% at 5 minutes and 94% at 10 minu-
teusListeria monocytoge- tes (Figure 1A). By representing CFU values
nes). on a logarithmic scale (Figure 1B), a good
La Figura 1 muestra los resultados de los rectification of the clearance graph was obtai-
2ensayos realizados con C. albicans. Las tasas ned, with a R = 0.9918, value, and the follo-
de depuración (referidas al recuento inicial de wing equation:
CFU, realizado al minuto de la inoculación) Y = -0.139 X + 4.330
fueron del 65% a los 5 minutos y del 94% a
los 10 minutos (Figura 1A). Al representar los
valores de CFU en escala logarítmica (Figura
1B), se obtuvo una buena rectificación de la
2gráfica de depuración, con un valor R = 0.9918,
y la siguiente ecuación:
Y = -0.139 X + 4.330
FIGURA 1FIGURA 1. Cinética de depuración de C. albicans.
FIGURE 1FIGURE 1. Kinetic clearance of C. albicans.
Tiempo (min) post-inoculación
15 6
BA
5
10
4
3
5
2
0 1
0 5 10 15 05 10 15
Tiempo (min) post-inoculación
Los resultados de depuración de E. coli se The results for E. coli clearance are repre-
presentan en la Figura 2. Las tasas de depu- sented in Figure 2. Clearance rates from 68%
ración fueron del 68% a los 5 minutos y del at 5 minutes and 90% at 10 minutes were
90% a los 10 minutos (Figura 2A). En escala obtained (Figure 2A). On a semilogarythmic
2 2semilogarítmica, se obtuvo un valor R = 0.9966 scale, a R = 0.9966 value was obtained with
y la siguiente ecuación: the following equation:
Y = -0.110 X + 5.393 Y = -0.110 X + 5.393
FIGURA 2.FIGURA 2. Cinética de depuración de E. coli
FIGURE 2.FIGURE 2. Kinetic clearance of E. coli
Tiempo (min) post-inoculación
6
B
250 5
A
200 4
150 3
100 2
50 1
0 5 10 150
Tiempo (min) post-inoculación0 5 10 15
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3
CFU por ml de sangre (x10 ) 3
CFU por ml de sangre (x10 )
CFU por ml de sangre (log)
CFU por ml de sangre (log)ALKOUWALTLI K, LEIVA M, RUIZ-BRAVO A, JIMÉNEZ-VALERA M48
La Figura 3 muestra los resultados obteni- Figure 3 shows the results obtained from
dos con M. luteus. Se encontraron unas tasas M. luteus, where clearance rates of 98% at 5
de depuración 98% (5 minutos) y 99% (10 minutes and 99% at 10 minutes were obtai-
minutos) (Figura 3A). Al pasar a la escala ned. (Figure 3A). After converting to the se-
semilogarítmica, la rectificación no fue bue- milogarythmic scale, rectification values were
na, debido al gran descenso en el número de not found to be good, due to a sharp decrease
2CFUs registrado ya a los 5 minutos, con R = in the number of recorded CFUs at 5 minutes,
20.7845 y la siguiente ecuación: with con R = 0.7845 and the following equa-
Y = -0.219 X + 5.075 tion:
Y = -0.219 X + 5.075
FIGURA 3. Cinética de depuración de M. luteus
FIGURE 3. Kinetic clearance of
Tiempo (min) post-inoculación
200 6
A B
5
150
4
100
3
50
2
0 1
0 5 10 15 0 5 10 15
Tiempo (min) post-inoculación Time (min) post-innoculation
La Figura 4 corresponde a S. enterica sero- Figure 4 corresponds to S. enterica serovar
var Typhimurium. Las tasas de depuración Typhimurium. Clearance rates of 47% at 5
fueron 47% (5 minutos) y 58% (10 minutos). minutes and 58% at 10 minutes were obtai-
2 2En escala semilogarítmica, se obtuvo R = ned. R = 0.8989 was obtained on the semi-
0.8989. La ecuación fue: logarythmic scale, giving the equation:
Y = -0.041 X + 4.859 Y = -0.041 X + 4.859
FIGURA 4. Cinética de depuración de S. enterica serovar Typhimurium.
FIGURE 4. kinetic clearance of S. enterica serovar Typhimurium.
Tiempo (min) post-inoculación
6100
BA
80 5
460
40 3
20 2
0 1
0 5 10 15 0 5 10 15
Tiempo (min) post-inoculación
En la Figura 5 se presentan los datos obte- Figure 5 shows the data obtained for L.
nidos con L. monocytogenes. Se registraron monocytogenes. Clearance rates of 67% at 5
tasas de depuración de 67% (5 minutos) y minutes and 92% at 10 minutes were recor-
92% (10 minutos). La escala semilogarítmica ded. The semilogarythmic scale gave a straig-
2 2generó una recta (R = 1.0000), con la si- ht of (R = 1.0000), with the following equa-
guiente ecuación: tion:
Y = -0.122 X + 5.671 Y = -0.122 X + 5.671
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55.
3
CFU por ml de sangre (x10 )
3
CFU per ml of blood (x10 )
CFU por ml de sangre (log)
CFU per ml of blood (log)TÉCNICAS DE ESTUDIO DE FAGOCITOSIS IN VIVO Y SU APLICACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN... 49
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FIGURA 5. Cinética de depuración de L. monocytogenes
FIGURE 5. Kinetic clearance of
Tiempo (min) post-inoculación
6400
BA
5
300
4
200
3
100 2
0 1
0 5 10 15 0 5 10 15
Tiempo (min) post-inoculaciónTiempo (min) post-inoculación
6
El estudio comparativo de los diferentes The comparative study of the different test
microorganismos de prueba presenta unas ta- microorganisms presented clearance rates at 5
sas de depuración, a 5 y 10 minutos, de ran- and 10 minutes within similar ranges for C.
gos similares para C. albicans, E. coli y L. albicans, E. coli and L. monocytogenes. M.
monocytogenes. M. luteus fue muy sensible a luteus was found to be sensitive to in vivo
la fagocitosis in vivo, siendo eliminado ya en phagotosis, eliminated to the degree of 98%
un 98% a los 5 minutos de la inoculación: por at 5 minutes after inoculation: consequently,
este motivo, la regresión en la gráfica semilo- regression on the semilogarithmic graph was
garítmica no fue aceptable. Por el contrario, not acceptable. Conversely, S. enterica sero-
S. enterica serovar Typhimurium demostró una var Typhimurium showed noteworthy resis-
notable resistencia a la depuración, ya que la tance to clearance, given that the rates obtai-
tasa a 10 minutos fue inferior incluso a las ned at 10 minutes were even lower than those
tasas a 5 minutos de los otros microorganis- obtained at 5 minutes from other microorga-
mos. nisms.
FIGURA 6. Efecto del tratamiento con Azitromicina durante 10 días en la cinética de depuración de C.
albicans
FIGURE 6 Effect of Azithromycin treatment for 10 days on kinetic clearance of C. albicans.
Tiempo (min) post-inoculación
25 6
A B
20 5
15 4Control
Treated10 3
5 2
0 1
0 5 10 15 0 5 10 15
Tiempo (min) post-inoculación Time (min) post-innoculation
Entre los tres microorganismos con un Of the three microorganisms that present
comportamiento aceptable, la levadura C. al- acceptable behaviour, the yeast C. albicans
bicans fue seleccionada para la segunda parte was chosen for the second part of the study,
del trabajo, ya que su condición de célula given that as a eukaryotic cell, it is resistant
eucariota le hace resistente a la mayoría de to most antibacterial agents to be tested as
los agentes antibacterianos a ensayar como BRMs. Clearance test with C. albicans were
BRMs. Se realizaron, pues, ensayos de depu- therefore carried out in mice treated with azi-
ración de C. albicans en ratones tratados con thromycin for 10 and 20 days. The results
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3
CFU per ml of blood (x10 )
3
CFU por ml de sangre (x10 )
CFU per ml of blood (log)
CFU por ml de sangre (log)ALKOUWALTLI K, LEIVA M, RUIZ-BRAVO A, JIMÉNEZ-VALERA M50
azitromicina durante 10 y 20 días. Los resul- obtained after 10 days are presented in Figure
tados de las determinaciones tras 10 días se 6. Antimicrobial treatment did not affect the
presentan en la Figura 6. El tratamiento con el straights of regression: the average values for
2antimicrobiano no afectó a las rectas de re- R were 0.907 ± 0.1092, for control and 0.997
2gresión: los valores promedio de R fueron ± 0.0017 for treated animals (no significant
0.907 ± 0.1092, para los animales testigos, y difference). However, clearance rates within
0.997 ± 0.0017 para los tratados (diferencias the first 5 minutes were significantly higher in
no significativas). Sin embargo, la tasa de control (81%) than in treated animals (65%)
depuración en los primeros 5 minutos fue sig- (P < 0.05). Therefore, azithromycin treatment
nificativamente mayor en los animales testi- over a period of 10 days delayed kinetic clea-
gos (81%) que en los tratados (65%) (P < 0.05). rance of C. albicans, even though at 10 minu-
Por tanto, el tratamiento con azitromicina tes, significant differences were not apparent.
durante 10 días retardó la cinética de depura-
ción de C. albicans, aunque a los 10 minutos
las diferencias perdieron la significación.
FIGURA 7. C.FIGURA 7. Efecto del tratamiento con Azitromicina durante 20 días en la cinética de depuración de
albicans.
FIGURE 7. Effect of Azithromycin treatment for 20 days on kinetic clearance of C. albicans
Tiempo (min) post-inoculación
30 6
A B25 5
20
4Testigos
15
Tratados 3
10
25
0 1
0 5 10 15 0 5 10 15
Tiempo (min) post inoculación Tiempo (min) post-inoculación
A los 20 días de tratamiento con azitromi- After 20 days of azithromycin treatment,
cina, tampoco se registraron diferencias signi- no significant differences among the straights
2 ficativas entre las rectas de regresión, con valores of regression were observed. R values of 0.987
2de R de 0.987 ± 0,0141 para los animales ± 0,0141 for control animals and y 0.999 ±
testigos y 0.999 ± 0.0346 para los tratados 0.0346 for treated animals were obtained (Fi-
(Figura 7). En cuanto a las tasas de depura- gure 7). Similarly, with regard to clearance
ción, también aquí, a los 5 minutos, fue ma- rates, at 5 minutes the highest averages were
yor el promedio de los animales testigos (80%) obtained for control animals (80%) in compa-
que el de los tratados (61%), si bien la disper- rison with treated animals (61%). However,
sión de los datos impidió llegar a diferencias the dispersion of data did not produce signi-
significativas. ficant differences.
4. DISCUSIÓN 4. DISCUSSION
La depuración de carbón coloidal se ha The clearance of colloidal carbon has been
utilizado desde hace años como una medida used for many years as a measure of the func-
de la capacidadfuncional del sistema fagocíti- tional capacity of the phagocytic-mononuclear
11,12 11,12 13, 14co-mononuclear , y sigue recurriéndose a system , and is still being used today .
13, 14ella en la actualidad . Algunos trabajos han Some studies have shown a correlation bet-
mostrado una correlación entre este paráme- ween this parameter and the resistance to ex-
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55.
3
CFU por ml de sangre (x10 )
CFU por ml de sangre (log)TÉCNICAS DE ESTUDIO DE FAGOCITOSIS IN VIVO Y SU APLICACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN EN LA INVESTIGACIÓN... 51
PROCEDURES TO STUDY THE IN VIVO PHAGOCYTOSIS AND APPLICATION FOR THE INVESTIGATIÓN OF IMMUNOMODULATORY...
tro y la resistencia a infecciones experimenta- perimental infections produced by bacteria and
15 15les por bacterias y levaduras . Sin embargo, yeast . However, the use of live microorga-
el uso de microorganismos vivos constituye nisms constitutes a more representative approach
una aproximación más representativa de la to the determination of an organism’s defence
capacidad defensiva real del organismo. capacity.
La inmunidad innata se basa en la capaci- Innate immunity is based on the capacity
dad de determinadas células y moléculas para of determined cells and molecules to recogni-
reconocer estructuras comunes a amplios gru- se common to wide ranging groups of micro-
pos de microorganismos, denominadas PAMPs organisms, known as PAMPS(«pathogen-as-
16 16(«pathogen-associated molecular patterns») . sociated molecular patterns») . Numerous
Se han identificado diversos PAMPs en la PAMPS have been identified on the microbial
superficie microbiana: la mureína bacteriana, surface: the murine bacteria, the lipopolysac-
el lipopolisacárido (LPS) y las lipoproteínas charides (LPS) and the lipoproteins of Gram-
de bacterias Gram-negativas, los ácidos lipo- negative bacteria, lipoteichoic acids (Gram-
teicoicos (bacterias Gram-positivas), los lipoara- positive bacteria), lipoarabinomannan from
binomananos de micobacterias, el zimosán de mycobacterium, zymosan from yeasts, glyco-
levaduras, los glicoinositolfosfolípidos de Trypa- inositolphospholipids from Trypanosoma cruzi,
17nosoma cruzi, son diversos ejemplos de PAMPs are numerous examples of superficial PAMPS .
17superficiales . La interacción de los PAMPs The interaction between PAMPS and the mi-
de la superficie microbiana con sus recepto- crobial surface and their receptors
res (PRRs, «pattern recognition receptors») tiene (PRRs,»pattern recognition receptors») is hig-
gran importancia en la fagocitosis. Algunos hly important in phagocytosis. Some PRRs are
PRRs están ubicados en la superficie de célu- situated on the surface of phagocytic cells,
las fagocíticas, e intervienen en la unión de and have a part to play in the binding of
microorganismos como paso previo a la fago- microorganisms prior to phagocytosis. Other
citosis. Otros PRRs residen en moléculas plas- PRRs reside in the plasmatic molecules, be-
máticas, pertenecientes a sistemas como el longing to such systems as the complement,
complemento, que se activan en presencia de which are activated in the presence of micro-
microorganismos, liberando opsoninas que organisms, liberating opsonins, which facili-
facilitan la fagocitosis. Este tipo de interac- tate phagocytosis. These types of interactions
ciones no se pueden reproducir con partículas cannot be reproduced with inert particles.
inertes. Sin embargo, una limitación inherente However, an inherent limitation in the use of
al uso de microorganismos es la posible inter- microorganisms is the possible interference from
ferencia de anticuerpos con capacidad opso- antibodies possessing opsonizing capacity,
nizante, que podrían estar presentes en algu- which could be present in some animals befo-
nos animales previamente al ensayo, como re testing, due to sub clinical contact or cros-
consecuencia de contactos subclínicos o de sed reactions with environmental antigens. This
reacciones cruzadas con antígenos ambienta- limitation should be considered when working
les. Esta limitación debe ser considerada cuando with ubiquitous microorganisms such as E.
18se trabaja con microorganismos ubicuos como coli .
18E. coli . There are no bibliographical precedents on
No hay antecedentes en la bibliografía sobre the comparison between in vivo clearance of
la comparación de la depuración in vivo de extra and intracellular pathogens. Our data
patógenos extra- e intracelulares. Nuestros datos shows differences between the two intracellu-
muestran divergencia entre las dos bacterias lar bacteria tested, L. monocytogenes and S.
intracelulares ensayadas, L. monocytogenes y enterica serovar Typhimurium. The clearan-
S. enterica serovar Typhimurium. La depura- ce of L. monocytogenes was similar to that of
ción de L. monocytogenes fue similar a la de E. coli, while S. enterica serovar Typhimu-
E. coli, mientra que S. enterica serovar Typhi- rium showed a noteworthy resistance to clea-
murium reveló una notable resistencia a la rance. Both intracellular pathogens are cha-
depuración. Ambos patógenos intracelulares racterised by their survival capacity inside
se caracterizan por su capacidad para sobre- macrophages, except when activated by cyto-
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55ALKOUWALTLI K, LEIVA M, RUIZ-BRAVO A, JIMÉNEZ-VALERA M52
vivir en el interior de macrófagos, excepto kins. In principle, this resistance should not
cuando estos están activados por acción de affect clearance kinetics, that is to say, the
citokinas. En principio, esta resistencia no capacity of fixed macrophages in the spleen
debiera afectar a la cinética de depuración, es and liver to withdraw bacteria from blood
decir, a la capacidad de los macrófagos fijos through phagocytosis. However, these intra-
de bazo e hígado para retirar bacterias de la cellular bacteria would survive in both organs,
sangre por fagocitosis, aunque las bacterias where they could proliferate and form absces-
intracelulares sobrevivirían en ambos órganos, ses. However, in the case of S. enterica serovar
donde podrían proliferar y formar abcesos. Sin Typhimurium, an additional virulence factor
embargo, en el caso de S. enterica serovar seems to exist, which allows the bacteria to
Typhimurium, parece que existe algún factor avoid phagocytosis. This factor could be attri-
de virulencia adicional, que permite a la bac- buted to the nature of the LPS O chain, given
teria evitar la fagocitosis. Este factor podría that a strain of S. enterica serovar Typhimu-
ser la naturaleza de la cadena O del LPS, ya rium with an O polysaccharide that is capable
que se ha descrito que una cepa de S. enterica of efficiently activating the alternative com-
serovar Typhimurium con un polisacárido O plement pathway, is efficiently cleared from
capaz de activar eficientemente la vía alterna- blood in comparison with a strain whose O
tiva del complemento, es eficazmente depura- chain does not efficiently activate the com-
da de la sangre, en comparación con otra cepa plement, with the last of these being the most
19cuya cadena O no es eficiente en la activa- virulent . In conclusion, it can be said that
ción del complemento, siendo esta última más clearance through in vivo phagocytosis is in-
19virulenta . Podemos concluir que la depura- fluenced to a greater extent by concrete viru-
ción por fagocitosis in vivo se ve influencia- lence factors (such as the nature of the LPS in
da por factores de virulencia concretos (como the case of Gram-negative bacteria), rather than
la naturaleza del LPS en el caso de bacterias the extra or intracellular nature of pathogens
Gram-negativas) en mayor extensión que por or the structure of the wall (defined by Gram
la condición de patógenos extra- o intracelu- staining).
lares o la estructura de la pared (definida por The decision to use C. albicans, as a means
la tinción de Gram). to measuring the effect of BRM of azithromy-
La elección de C. albicans para medir el cin, was based on kinetic clearance data, as
efecto BRM de la azitromicina se basó en los well as its resistance to this antibacterial agent
20 21,22datos de cinética de depuración, así como en in both in vitro and in vivo conditions.
su resistencia frente a este agente antibacte- Azithromycin has been used in long term
20 21,22riano, in vitro e in vivo . treatment for patients presenting cystic fibro-
La azitromicina ha sido utilizada en trata- sis (at least 3 months) and diffuse panbron-
mientos de larga duración, en enfermos de chiolitis, (at least 6 months), with good clini-
fibrosis quística (al menos 3 meses) y pan- cal results that may be attributable, at least in
23bronquiolitis difusa (al menos 6 meses), con part, to its antiinflammatory effects . Howe-
buenos resultados clínicos atribuibles, al me- ver, there is insufficient experimental eviden-
23nos en parte, a sus efectos antiinflamatorios . ce to clearly support this hypothesis, given
Sin embargo, no hay suficientes evidencias the scarcity of studies carried out on the role
experimentales que soporten claramente esta of BRM activity in this type of treatment.
hipótesis, dada la escasez de estudios sobre As in the case of other macrolides, azi-
actividad BRM en este tipo de tratamientos. thromycin is concentrated to a noticeable degree
24Al igual que otros macrólidos, la azitromi- within the interior of phagocytes . However,
cina se concentra notablemente en el interior there is no agreement as to the possible effects
24de los fagocitos , pero no hay concordancia of such an accumulation on phagocytic func-
respecto a los posibles efectos de esta acumu- tions. The differing parameters measured in
lación en las funciones fagocíticas. Los dis- each case may be responsible for these dis-
tintos parámetros medidos en cada caso pue- crepancies. Chemiluminiscence in human neu-
den ser responsables de estas discrepancias. trophiles was not altered by azithromycin treat-
20,25 25La medida de quimioluminiscencia en neutró- ments in ex vivo and in vitro tests.
Ars Pharm 2005; 46 (1): 43-55.