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PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO

TESIS DOCTORAL

MARÍA VIDAL GARCÍA


Salamanca, Octubre 2009
















DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS DE CASTILLA Y LEÓN





PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO


Memoria presentada por María Vidal García para optar al grado de
Doctor por la Universidad de Salamanca

Director:
Prof. Dr. D. Jesús María García Briñón



Octubre 2009














DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS DE CASTILLA Y LEÓN





PAPEL DE LA PROTEÍNA DOBLECORTINA EN
LOS PROCESOS DE NEUROGÉNESIS Y
MIGRACIÓN NEURONAL EN EL SISTEMA
NERVIOSO CENTRAL ADULTO



María Vidal García



Octubre 2009

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Son muchas las personas a las que quiero dar las gracias por participar, de un
modo u otro, en la realización de este trabajo. Me gustaría dedicar las primeras líneas a
las que son las personas más importantes en mi vida, a mis padres y a David. Quiero
agradecer a mis padres su apoyo incondicional y su fuerza, soy lo que soy gracias a
ellos y, de la forma más sincera, creo que nadie lo podría haber hecho mejor. Me
gustaría dar las gracias a David por su paciencia, sus consejos, su confianza, por
hacerme sentir segura y hacer que camine siempre hacia delante.
Quiero agradecer a mi Director de Tesis, el Dr. Jesús García Briñón, todo el
esfuerzo, el trabajo y el empeño que ha dedicado durante estos años a la realización de
este proyecto, especialmente en los últimos meses, en los que ha trabajado a
contrarreloj.
Me gustaría agradecer al Dr. Jordi Alberch y al Dr. Josep Canals por abrirme las
puertas de su laboratorio y tratarme como un miembro más del grupo. Quiero además,
dar las gracias a todo su equipo, pero de forma especial a Raquel, Miriam, Cris y a
Noelia… os echo de menos chicas!
Gracias a la Dra. Tabernero, al Dr. Medina y a todo su equipo, especialmente a
André y a Vega, por ayudarme en mis inicios con los cultivos primarios y con las
transfecciones.
Gracias al Dr. Didier Trono y al Dr. Antonio Bernad por su amabilidad a la hora de
cederme los plásmidos necesarios para que el proyecto despegara.
Gracias al Dr. Juan Pedro Bolaños y a todo su equipo por su ayuda con algunas de
las construcciones vectoriales.
Gracias a Ana, Lorena y Lau por ser mi apoyo, por ser como son, por encontrar
siempre la palabra de ánimo, o porque a veces vale sin hablar… gracias por estar ahí.
Gracias también a toda mi familia por su confianza, y por no tener en cuenta las horas
que nos ha “robado” esta Tesis.
He querido reservar estas últimas líneas para dar las gracias a todos y cada uno de
los miembros del Dpto. de Biología Celular y a todo el Instituto de Neurociencias de
Castilla y León, donde he podido aprender y desarrollarme en todos los aspectos.
Quiero agradecer de forma especial el apoyo, personal y profesional, de mis
compañeros de laboratorio. En mi opinión no hace falta nombrar a nadie, creo que se
reconocerán en mis palabras. Lo mejor de todos estos años ha sido poder venir a
trabajar con una sonrisa. Las personas no podemos elegir la gente con la vamos a
trabajar, pero si pudiera elegir, nadie mejor que vosotros.
Gracias a todos los que en este trabajo habéis puesto manos, cabeza y corazón.

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
NEUROGÉNESIS EN EL SNC ADULTO .......................................................................... 3
Nichos neurogénicos .................................................................................................................. 4
Regulación de la neurogénesis .................................................................................................. 5
Hormonas ......................................................................................................................................... 5
Neurotransmisores .......................................................................................................................... 6
Factores de crecimiento o neurotrofinas ...................................................................................... 6
Moléculas de adhesión celular ...................................................................................................... 8
SIGNIFICADO FUNCIONAL DE LA NEUROGÉNESIS ............................................... 9
SISTEMA ZSVBO ............................................................................................................... 11
ZSV adulta: estructura y tipos celulares. ............................................................................... 11
Bulbo olfatorio principal: estructura y función ..................................................................... 15
Células de nueva generación del bulbo olfatorio ................................................................. 19
MECANISMOS DE MIGRACIÓN CELULAR ................................................................ 23
Migración radial ........................................................................................................................ 23
Migración tangencial ................................................................................................................ 25
MIGRACIÓN CELULAR EN LA CMR Y BO ................................................................. 25
Desarrollo embrionario vs. Desarrollo postnatal .................................................................. 28
ALTERACIONES EN LA MIGRACIÓN CELULAR: LISENCEFALIAS .................... 30
Doblecortina............................................................................................................................... 32
RNA DE INTERFERENCIA .............................................................................................. 35
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................................ 39
MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................... 43
ANÁLISIS IN VITRO .......................................................................................................... 45
Cultivos primarios de neuronas corticales ............................................................................ 45
Transfección con siRNA ............................................................................................................... 46
Westernblot .............................................................................................................................. 46
Preparación de los geles ............................................................................................................... 47
Electroforesis y transferencia ....................................................................................................... 47
Inmunodetección ........................................................................................................................... 48
Inmunofluorescencia para cultivos primarios ...................................................................... 49
Construcciones vectoriales ...................................................................................................... 50
Diseño de los oligonucleótidos DCXshRNA y scrambleDCXshRNA ................................... 50
Modificación del ADN plasmídico ............................................................................................. 52
Reacción de ligación ...................................................................................................................... 53
Transformación bacteriana .......................................................................................................... 53
Obtención de ADN plasmídico ................................................................................................... 53
Northern blot ............................................................................................................................. 53
Extracción de RNA enriquecido en RNA de pequeño tamaño ............................................... 54
Preparación de los geles de acrilamida y electroforesis ........................................................... 54
Transferencia.................................................................................................................................. 55
Marcaje de la sonda e hibridación ............................................................................................... 55
Producción de partículas lentivirales ..................................................................................... 56
Cultivo de la línea celular 293FT ..................................................................................................... 57
Cotransfección de las células 293FT con plásmidos virales ..................................................... 58
Concentración ................................................................................................................................ 58
Titulación viral............................................................................................................................... 59
Cultivos de progenitores embrionarios de LGE de ratón.................................................... 60
Mantenimiento .............................................................................................................................. 60
Análisis de diferenciación ............................................................................................................ 61
Inmunofluorescencia y westernblot .......................................................................................... 63

Extracción de RNA ........................................................................................................................ 63
Transducción lentiviral de los progenitores embrionarios ...................................................... 63
Ensayo de PCR cuantitativa .................................................................................................... 64
ANÁLISIS IN VIVO ............................................................................................................ 65
Inyecciones estereotáxicas ....................................................................................................... 65
Obtención y preparación del tejido ........................................................................................ 66
Sacrificio y disección ..................................................................................................................... 66
Seccionamiento .............................................................................................................................. 67
Inmunohistoquímica convencional ........................................................................................ 67
Controles de la técnica inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia ............................... 68
Cuantificación ............................................................................................................................ 69
Análisis cuantitativos de GFP ...................................................................................................... 69
Análisis estadísticos .................................................................................................................. 70
Documentación y tratamiento de imágenes .......................................................................... 70
RESULTADOS ......................................................................................... 71
SILENCIAMIENTO IN VITRO MEDIANTE siRNA ...................................................... 73
CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN CONSTITUTIVA DE shRNA
................................................................................................................................................ 73
Determinación de la expresión de shRNA mediante northerblot ..................................... 74
GENERACIÓN DE LENTIVIRUS RECOMBINANTES ................................................ 74
SILENCIAMIENTO IN VITRO MEDIANTE shRNA ..................................................... 79
Determinación de la expresión de doblecortina ................................................................... 80
Infección con lentivirus recombinantes ................................................................................. 83
Determinación del grado de silenciamiento .............................................................................. 83
Efecto del silenciamiento sobre la expresión de otros genes ................................................... 83
SILENCIAMIENTO IN VIVO MEDIANTE shRNA ....................................................... 84
Determinación del grado de silenciamiento .......................................................................... 89
Efectos producidos por el silenciamiento de doblecortina .................................................. 89
Análisis de migración tangencial ................................................................................................ 89
Tipos morfológicos de células de nueva generación ................................................................ 90
Análisis de migración radial ........................................................................................................ 97
Efectos sobre la diferenciación .................................................................................................. 105
DISCUSIÓN ........................................................................................... 119
iRNA COMO HERRAMIENTA DE ESTUDIO ............................................................. 121
Consideraciones técnicas ....................................................................................................... 122
Lentivirus como vehículos de expresión ............................................................................. 123
EXPRESIÓN DE DOBLECORTINA EN PROGENITORES EMBRIONARIOS DE
LGE ...................................................................................................................................... 126
El silenciamiento in vitro de doblecortina reduce los niveles del mRNA de Tuj1.......... 127
SILENCIAMIENTO DE DOBLECORTINA EN PROGENITORES DE LA SVZ
ADULTA ............................................................................................................................ 129
Grado de silenciamiento de doblecortina ............................................................................ 130
Migración tangencial a través de la CMR en roedores adultos. ....................................... 131
El silenciamiento de doblecortina provoca la aparición de células multipolares. ......... 134
Migración radial a través del BO en roedores adultos ....................................................... 136
Diferenciación temprana de los granos de nueva generación del BO ............................. 138
CONCLUSIONES .................................................................................. 141
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 145