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DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Y BIOLOGÍA MOLECULAR



TESIS DOCTORAL







Efecto de la quercetina y la rutina frente al
daño oxidativo inducido en eritrocitos con
distintos contenidos de colesterol.





JOSÉ IGNACIO SÁNCHEZ GALLEGO

Salamanca, 2009






DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Campus Miguel de Unamuno - Edificio Departamental
Pza. Doctores de la Reina s/n 37007 Salamanca. Spain.
Tel.+34-923 294 465 Fax:+34-923 294 579








MARCIAL LLANILLO ORTEGA, Profesor Titular de Universidad del
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de
Salamanca,


HAGO CONSTAR,


Que la presente Memoria de Tesis Doctoral titulada “Efecto de la
quercetina y la rutina frente al daño oxidativo inducido en eritrocitos con
distintos contenidos de colesterol”, de la que es autor D. José Ignacio SÁNCHEZ
GALLEGO y que presenta para optar al Grado de Doctor en Biología, ha sido
realizada bajo mi dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular de la Universidad de Salamanca. Considero que dicha Tesis Doctoral
se halla concluida, y por tanto, autorizo su presentación para que sea juzgada
por el Tribunal correspondiente.

Y para que así conste, firmo el presente documento en Salamanca a
diecisiete de febrero de dos mil nueve.








DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Campus Miguel de Unamuno - Edificio Departamental
Pza. Doctores de la Reina s/n 37007 Salamanca. Spain.
Tel.+34-923 294 465 Fax:+34-923 294 579











JOSÉ IGNACIO SÁNCHEZ GALLEGO, licenciado en Biología y Bioquímica por la
Universidad de Salamanca,


HAGO CONSTAR,


Que soy autor de la Tesis Doctoral titulada “Efecto de la quercetina y la
rutina frente al daño oxidativo inducido en eritrocitos con distintos contenidos
de colesterol”, realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
de la Universidad de Salamanca bajo la dirección del Profesor Dr. Marcial
Llanillo.

Y para que así conste, firmo el presente documento en Salamanca a
diecisiete de febrero de dos mil nueve.

NOTA PRELIMINAR

Este trabajo de investigación ha sido financiado con cargo a los
proyectos subvencionados por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Plan
I+D+i, “Efecto de la peroxidación sobre la estructura-función de los eritrocitos
enriquecidos en colesterol” Ref. BMC2000-1132), la Universidad de Salamanca
(“Protecciones aportadas por quercetina y rutina frente al daño oxidativo
inducido por radicales libres de oxígeno en eritrocitos modificados en sus
contenidos de colesterol” Ref. USAL2005B1-13) y la Junta de Castilla y León
(Ref. SA058A07).

El autor de la Memoria ha disfrutado de una Beca de Investigación de la
Junta de Castilla y León (Junio 2003-Junio 2007).

Los resultados recogidos en esta Memoria han sido en parte publicados
en un artículo y presentados en los siguientes Congresos:

Artículo:

López-Revuelta, A., Sánchez-Gallego, J.I., Hernández-Hernández, A., Sánchez-
Yagüe, J. y Llanillo, M.
Membrane cholesterol contents influence the protective effects of quercetin and
rutin in erythrocytes damaged by oxidative stress
Chemico-Biological Interactions 161(2006)79-91


Congresos:

1. II Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Orihuela
(Alicante, España), 3-6 de Junio de 2003. “Actividad biológica de la quercetina y
la rutina frente al daño oxidativo en eritrocitos enriquecidos en colesterol”.
Volumen 1, pág 109-112.

2. XXVII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular,
Lleida (España), 12-15 de Septiembre de 2004. “Relación entre el contenido en
colesterol de los eritrocitos y su susceptibilidad al daño oxidativo inducido por
hidroperóxido de ter-butilo. Protección por antioxidantes”. Resumen P12-3, pág
216.

3. XXX Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular,
Málaga (España), 12-15 de Septiembre de 2007. “Influencia del colesterol en la
disposición asimétrica de los aminofosfolípidos de membrana en eritrocitos
oxidados con hidroperóxido de ter-butilo. Efectos protectores de quercetina y
rutina. Resumen T06-16, pág 152.










































Abreviaturas







Abreviaturas

APLT: Aminofosfolípido translocasa.
Anexina V-FITC: Proteína anticoagulante anexina V conjugada con el
compuesto fluorescente isotiocianato de fluoresceina.
BCD: β-ciclodextrina.
BHA: 3-t-butil-4-hidroxianisolona.
BHT: Hidroxitoluenobutilado.
BSA: Seroalbúmina bovina.
BSF: Suero bovino fetal.
Ch: Colesterol.
COMT: Catecol-O-metiltransferasa
CPD-A : Anticoagulante citrato/fosfato/glucosa/adenina. 1
DCF: 2´,7´-diclorofluoresceina.
DCFDA: Diacetato de diclorodihidrofluoresceina.
DCFH : 2´,7´-diclorodihidrofluoresceina. 2
D.E.: Desviación estándar de la media.
DHEAS: Dehidroandrosterona 3-sulfato.
DMSO: Dimetilsulfósido.
DPG: Difosfatidilglicerol ó Cardiolipina.
DPH: 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno.
DTNB: 5-5´-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico).
FAME: Ésteres metílicos de ácidos grasos.
FID: Detector de ionización de llama.
FITC: Isotiocianato de fluoresceina.
F-OH: Flavonoide
FSC: Forward scatter (dispersión frontal de luz)
GC: Cromatografía en fase gaseosa.
GC-MS: Cromatografía en fase gaseosa acoplada a espectrometría de masas.
GSH: Glutation reducido.
GSSG: Glutation oxidado.
Hb: Hemoglobina.
HBS : Disolución amortiguadora de HEPES 10 mM, KCl 150 mM, pH 7,4. 1
HBS : Disolución amortiguadora de HEPES 10 mM, NaCl 145 mM, pH 7,4. 2
HEPES: Ácido N-[2-hidroxietil]piperacina-N’-[2-etanosulfónico].
HOO•: Radical perhidroxilo.
IAA: Ácido indolacético.
LDL: Lipoproteínas de baja densidad
MBCD: Metil-β-ciclodextrina.
MDA: Malonildialdehído.

Abreviaturas

MetHb: Metahemoglobina.
MS: Espectrometría de masas.
NBD-PS: 1-Palmitoil-2-[6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]hexanoil]-
sn-glycero-3-phosphoserine
NEM: N-etilmaleimida.
•O : Radical superóxido. 2
•OH : Radical hidroxilo.
P: Polarización de fluorescencia.
PA: Ácido fosfatídico.
PBS: Disolución amortiguadora de fosfato sódico 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5.
PC: Fosfatidilcolina.
PDE: Fosfodiesterasa
PE: Fosfatidiletanolamina.
Pi: Fósforo inorgánico (procedente de lípidos).
PI: Fosfatidilinositol.
PL: Fosfolípido.
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo.
PRP: Plasma rico en plaquetas.
PS: Fosfatidilserina.
PUFA: Ácidos grasos poliinsaturados.
p/v: Peso/volumen.
PVP: Polivinilpirrolidona.
Q: Quercetina
Rf: Coeficiente de reparto.
•R : Radical libre
RNS: Especies reactivas de nitrógeno
•RO : Radical alcoxilo
•ROO : Radical peroxilo.
ROOH: Hidroperóxido lipídico.
ROS: Especies reactivas de oxígeno.
r : Anisotropía de fluorescencia. s
Ru: Rutina
SBF: Suero bovino fetal
SDS: Lauril sulfato sódico.
SM: Esfingomielina.
SOD: Superóxido dismutasa.
SSC: Side scatter (dispersión lateral de luz).
TBA: Ácido tíobarbitúrico.

Abreviaturas

TBARS: Sustancias reaccionantes con el ácido tiobarbitúrico.
tBHP: Hidroperóxido de ter-butilo.
•t-BuO : Radical butoxilo.
TCA: Ácido tricloroacético.
TEAC: Actividad antioxidante equivalente en Trolox
THF: Tetrahidrofurano.
TLC: Cromatografía en capa fina.
TMA-DPH: 1-[4-(trimetilamonio)-fenil]-6-fenil-1,3,5-hexatrieno.
TRIS: tris[hidroximetil]aminometano.
UFR: Unidades de fluorescencia relativa
UV: Ultravioleta
v/v:Volumen/volumen.












































































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