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UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR INSTITUTO DE NEUROCIENCAS DE CASTILLA Y LEÓN
Efectodelacocaína sobre eldesarrollo yregulación
del sistema dopaminérgicoenembrionesde pezcebra
Katherine Barreto Valer 2011
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR INSTITUTO DE NEUROCIENCAS DE CASTILLA Y LEÓN
Efectodelacocaína sobre eldesarrollo yregulación
del sistema dopaminérgicoenembrionesde pezcebra
Memoria, presentada por Katherine Barreto Valer
para optar al título de Doctor
por la Universidad de Salamanca
Katherine Barreto Valer
DRA. Dña. RAQUEL E. RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ, CATEDRÁTICO DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA. CERTIFICA: Que el trabajo titulado “Efecto de la cocaína sobre el desarrollo y
regulación del sistema dopaminérgico en embriones de pez cebra,
que presenta la doctorando Dña. Katherine Barreto Valer, ha sido
realizado bajo su dirección en el Instituto de Neurociencias de Castilla y
León, y en del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la
Universidad de Salamanca, y reúne a su juicio, originalidad y contenidos
suficientes para que sea presentado ante el tribunal correspondiente y
optar al Título de Doctor por la Universidad de Salamanca.
Y para que así conste, y a los efectos oportunos, expide el presente
certificado.
Salamanca a 14 de Noviembre de 2011.
Fdo. Prof. Raquel E. Rodríguez Rodríguez
Esta tesis está dedicada:
A mi esposo por su cariño, gran espíritu y
constante apoyo.
A mis padres por sus enseñanzas, consejos y
estímulo a seguir siempre adelante.
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
A la Prof. Raquel E. Rodríguez por su valiosa ayuda, por darme la oportunidad de inmiscuirme en la ciencia, por su confianza brindada durante todo este tiempo, por su apoyo y consejos en el campo científico y también personales, mis más sinceros agradecimientos.
Al doctor Javier Herrero por su amistad y ayuda incondicional brindada en todo momento desde mí llegada.
A todos mis compañeros de laboratorio con quienes he compartido momentos de trabajo y he aprendido un poco más de las cosas que ofrece la ciencia. A la Dra. Verónica Gonzáles por sus consejos, ayuda y sus charlas de ciencia. Al Dr. Ezequiel Marrón por su ayuda y lecciones durante mis primeros instantes en el laboratorio. A la Dra. Fátima Macho por todo el apoyo que me ha proporcionada en la realización del trabajo de la tesis doctoral, por su amistad y ayuda incondicional, a Ada por su alegría y manera de ser, a los nuevos integrantes que se vienen sumando y renovando las ilusiones del grupo del laboratorio 13.
A mis amigas y amigos: a Tao, Yanneri, Blanca, Flora, Verónica, Ernesto, Mauricio, Rosario, con quienes iniciamos este recorrido y aún seguimos en la misma dirección de la investigación, por su amistad y haber compartido momentos inolvidables, gracias por su amistad brindada.
A Roger por su inmenso corazón y enseñarme a ver la vida de otro modo, por los gratos momentos compartidos, y soporte emocional, por su ayuda y apoyo incondicional y por sobretodo su comprensión y paciencia.
A mis padres por todo el esfuerzo que han dedicado a mi formación, por ofrecerlo todo, por querer siempre lo mejor para sus hijas, son mi motivo para seguir adelante. A mis hermanas, Rocío, Giovanna y Patricia, por los buenos momentos compartidos, por su amistad, por apoyo ofrecido y brindado en todo momento. A mis sobrinos por regalarme su cariño inconmensurable y encontrar en cada abrazo y beso un sincero afecto. A Alex, Jan y Felicia.
A mis cuñados, Klaus y Dieter, por su don de persona y su manera de ser, por su hospitalidad y afecto.
Además gracias a:
Gracias a la Agencia Universitaria Iberoamericana de Postgrado (AUIP) por la Beca de Movilidad para estudios de Máster de en la Universidad de Salamanca, para el periodo académico 20082009, que se me fue concedida.
Gracias al proyecto de LA MARATÓ TV3 de Barcelona por el contrato ofrecido, el que me ayudo a continuar mis estudios de doctorado durante el 20092010.
Gracias al Dr. Luis Fernando Alguacil de la Universidad CEU San Pablo, Madrid España por proporcionarnos el clorhidrato de cocaína.
Gracias al Dr. Daniel S. Kessler del Departamento de Biología Celular y Desarrollo de la Universidad de Pennsylvania por proporcionarnos las ribosondas del factor de transcripciónlmx1b.1 y lmx1b.2.
INDICE
1.9.5. Factores de transcripción y su función en el
2. Hipótesis y Objetivos
38
37
35
38
32
1
2
16
10
11
8
25
20
23
1.9. Factores de transcripción relacionados con el desarrollo
1.1. Adicción
1.5. Sistema dopaminérgico endógeno
1.9.3. El factor de transcripción Lmx1b
1.2. La cocaína como droga de abuso
1.9.2. Pitx3
1.9.1. El receptor hormonal nuclear huérfano Nurr1
 desarrollo de las neuronas dopaminérgicas
1. Introducción
1.8. Sistema dopaminérgico en el pez c ebra
1.11. Modelos animales empleados en la investigación de la
1.12. Pez cebra como herramienta de estudio
1.7. Receptores de dopamina
1.13. Nomenclatura de los genes y las proteínas
1.9.6. La señalización Nodal
1.4. Exposición prenatal a cocaína
 de las neuronas dopaminérgicas y la señalización Nodal
ÍNDICE
1.3. Mecanismos de acción de la cocaína
24
28
13
3
6
7
31
17
18
1.10. Regulación transcripcional por los micro RNAs
1.9.4. La proteína Ortopedia (Otp)
2.1. Hipótesis general
1.6. Síntesis de la dopamina
 biomedicina
2.2. Objetivo general
embrionario del pez cebra.
4.2. Análisis del efecto de la cocaína sobre la expresión de la tirosina
3.5. Cuantificación de las muestras de RNA
2.3. Objetivos específicos
3.10. PCR a Tiempo real (qPCR)
4. Resultados
3.14. Clonación de la región 3’UTR de Pitx3
3.9. Reacción en cadena de la polimersa (PCR)
3.13. Inmunohistoquímica (IHC)
4. 2.1. Análisis de la expresión de lathpor efecto de la cocaína
3.3. La extracción de RNA total de embriones de pez cebra
4.1. Expresión de receptores dopaminérgicos durante el desarrollo
3.15. Microinyección de morfolinos y de DNA
3.16. Análisis de las imágenes
3.17. Análisis estadístico
3.12. Hibridación in situ (ISH)en embriones enteros
3.11. Análisis de la expresión génica por qPCR
3.8. Tratamiento de cDNA con RNasa A
3. Material y métodos
3.4. Tratamiento de RNA total con DNasa I
3.7. Síntesis de cDNA de microRNAs
hidroxilasa (th) y del transportador de dopamina (dat)
69
76
64
56
47
49
49
46
42
46
44
53
50
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79
47
75
38
42
3.2. Exposición de cocaína a los embriones de peces cebra
58
64
59
66
61
57
3.6. Obtención de cDNA
4.2.2. Análisis de la expresión del dat por efecto de la cocaína
3.1. Mantenimiento y cría de embriones
4.3. Análisis de la expresión denurr1, pitx3, lmx1b.1, lmx1b.2, otpa,